新城疫病毒V蛋白的表达及其对干扰素活性影响的研究

论文摘要

新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）可以在鸡群中引发以呼吸道、神经系统或是肠道病变为主要症状,具有高度传染性的疾病。由于危害严重,其致病和免疫机理一直是研究的热点。干扰素（IFN）系统是宿主抵抗病毒感染的第一道防线,近年来的研究结果发现副粘病毒通过RNA编辑作用产生的V蛋白具有阻断IFN抗病毒活性的功能,因而和病毒的致病性有着密切关系。NDV属于副粘病毒科禽腮腺炎（Avulavirus）病毒属,其基因组编码六种主要结构蛋白,其中P基因可以通过“RNA编辑”的方式编码产生额外的两个非结构蛋白—V蛋白和W蛋白。NDV的V蛋白与其他副粘病毒的V蛋白一样具有相似的特殊结构,可能与NDV毒力有密切关系。为了深入研究NDV V蛋白的功能及其与病毒致病性的关系,我们通过RT-PCR方法分别获得鸡、鸽和鹅源NDV V蛋白的cDNA,然后分别通过原核表达的重组V蛋白和真核表达载体,在体内外研究了V蛋白对NDV诱生IFN活性的影响,比较了不同宿主V蛋白功能的差异。本试验根据NDV P基因序列分别设计合成三条特异性引物,V1和V3用于基因扩增,V2是用来插入G的突变引物。采用RT-PCR方法分别从鸡、鸽、鹅源NDV尿囊液中扩增、克隆出NDV部分P基因cDNA,以cDNA为模板, V1和V2为引物PCR扩增V基因的前半段序列并引入了相应的突变。然后以该产物为引物和V3一起通过PCR方法分别获得鸡、鸽和鹅源NDV V基因全长cDNA并将其克隆到pMD18-T载体上,筛选到的鸡、鸽、鹅源NDV V基因阳性重组质粒分别命名为pMD18-T-c-V、pMD18-T-p-V和pMD18-T-g-V。对我们获得的cDNA我们进行了核苷酸序列测定。通过和GenBank中发表的其它副粘病毒V基因序列同源性比较结果可以发现:NDV V蛋白的羧基端同样含有七个半胱氨酸残基,分别位于第196、200、212、214、217、221和224位,这七个C所形成的结构可以结合两个Zn2+离子,形成典型的C2H2或C3H4型锌指基序,这种结构在所有副粘病毒科的成员中存在,可能与病毒的抗干扰素活性和病毒毒力有关。从进化树上可以看到:利用V蛋白进行NDV遗传演化分析所得的结果和通过NDV F基因进行分析的结果相一致,提示NDV V基因和其它基因一样在不断地的演化当中,并且可能NDV的毒力强弱有一定的相关性。同样副粘病毒的V蛋白可能是决定副粘病毒分类地位重要依据之一。本研究中鸡、鸽、鹅源NDV V基因的核苷酸和氨基酸与La Sota、Clone30、Hert33、QueenslandV4、ZJ1等NDV分离株相应的序列的同源性比较结果发现:相同宿主来源的毒株无论在核苷酸还是在氨基酸水平上的同源性都很高,这一点在鹅源和鸽源上体现的比较充分,但是鸡源在核苷酸和氨基酸上的同源性相对较低,核苷酸多集中在80-85%之间,而氨基酸则多集中在75-80%之间。鸽源和鹅源在V蛋白上均具有特殊的氨基酸残基,这些氨基酸的点突变能否对影响到所在基因的功能?是否具有宿主特异性?有待进一步的研究来解释。由于V蛋白是非结构蛋白且表达量不是很高,很难从病毒感染细胞中提取。也正是这一原因,导致对其功能研究的相对滞后。为了从根本上解决研究V蛋白功能的这一瓶颈问题我们将鸡源NDV F48E9的V基因cDNA构建到原核表达载体pET-30c上,构建成F48E9株NDV V蛋白的高效原核表达系统。该表达系统表达重组V蛋白以包涵体的形式存在,分子量大小为28KD左右。我们采用8mol/L脲变性,Ni-NTA柱吸附纯化了重组蛋白,经透析复性,得

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 引言
• 1.1 新城疫病毒研究概况与相关进展
• 1.1.1 新城疫病毒的一般生物学特性
• 1.1.2 新城疫病毒的基因组特点
• 1.1.3 新城疫病毒致病的机制
• 1.1.4 新城疫病毒P 基因的RNA 编辑
• 1.2 副粘病毒抗IFN 作用机制
• 1.2.1 IFN 抗病毒作用的机理与副粘病毒RNA 编辑的关系
• 1.2.2 副粘病毒V 蛋白拮抗IFN 的研究进展
• 1.3 研究的目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 病毒及分子生物学相关材料
• 2.1.2 工具酶与主要试剂
• 2.1.3 实验仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 三种不同宿主（鸡、鸽、鹅）新城疫病毒部分P 基因的克隆
• 2.2.2 三种不同宿主（鸡、鸽、鹅）新城疫病毒V 基因的克隆
• 2.2.3 鸡新城疫病毒F48E9株V 基因在大肠杆菌中的表达及其抗血清的制备
• 2.2.4 三种不同宿主新城疫病毒V 基因真核表达载体的构建
• 2.2.5 NDV V 蛋白重组质粒真核表达及Western blot 检测
• 2.2.6 MTT 法检测NDV V 蛋白拮抗IFN 的活性研究
• 2.2.7 动物体内NDV V 蛋白拮抗IFN 活性的研究
• 3 实验结果
• 3.1 三种不同宿主新城疫病毒 NDV 部分P 基因的克隆
• 3.2 三种不同宿主新城疫病毒 NDV V 基因的克隆
• 3.2.1 NDV V12 片段的PCR 扩增
• 3.2.2 NDV V 基因的PCR 扩增
• 3.2.3 NDV V 基因序列比较
• 48E₉ 株V 基因原核表达载体的构建'>3.3 NDVF₄₈E₉ 株V 基因原核表达载体的构建
• 48E₉ 株V 基因在大肠杆菌中表达研究'>3.4 NDVF₄₈E₉ 株V 基因在大肠杆菌中表达研究
• 48E₉ 株V 基因在大肠杆菌中表达及鉴定'>3.4.1 NDVF₄₈E₉ 株V 基因在大肠杆菌中表达及鉴定
• 3.4.2 目的蛋白最佳表达条件的优化
• 3.4.3 目的蛋白的纯化
• 3.4.4 目的蛋白的Western blot 检测
• 3.5 NDV V 基因真核表达载体的构建
• 3.5.1 三种宿主的NDV V 基因真核表达载体的构建及鉴定
• 3.5.2 NDV V 蛋白在Vero 细胞中的表达
• 3.6 V 蛋白功能研究
• 3.6.1 NDV 诱导IFN 最佳条件的确定
• 3.6.2 MTT 法体外检测NDV V 重组蛋白拮抗IFN 活性
• 3.6.3 动物免疫实验体内检测F48E9株 NDV V 蛋白拮抗IFN 活性
• 4 讨论
• 4.1 NDV V 基因的克隆和序列分析
• 4.1.1 NDV V 基因的克隆
• 4.1.2 V 基因的序列分析
• 4.2 NDV V 蛋白的表达
• 48E₉ 株V 蛋白的原核表达和抗血清的制备'>4.2.1 NDVF₄₈E₉ 株V 蛋白的原核表达和抗血清的制备
• 4.2.2 鸡、鸽和鹅源NDV V 蛋白真核表达载体的构建
• 4.3 NDV V 蛋白功能研究
• 4.3.1 NDV 重组V 蛋白体外拮抗IFN 的研究
• 4.3.2 动物免疫试验检测NDV V 重组蛋白拮抗IFN 活性
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录A V 基因克隆路线
• 附录B NDV V 基因核苷酸序列比较
• 48E₉株NDV V 基因原核表达载体的构建'>附录CF₄₈E₉株NDV V 基因原核表达载体的构建
• 附录D NDV V 蛋白基因真核表达载体的构建
• 附录E 试验主要试剂的配制
• 攻读博士研究生期间发表的论文