转CBF3基因马铃薯提高抗冷性的研究

论文摘要

低温对植物造成的伤害,表现为膜的损伤,活性氧和自由基含量增加以及一些渗透调节物质的积累等。这些现象的出现主要是由于低温对植物细胞膜系统的伤害,导致参与生命活动的各种酶的结构被破坏,活性降低,从而使细胞的代谢系统紊乱。植物光系统对低温胁迫非常敏感,在低温逆境条件下活性氧的大量积累,导致光合机构因受氧化胁迫而受损伤,光化学效率下降,同时催化光合暗反应的酶活性也因对低温敏感而降低,最终表现为光合速率的下降。本研究以拟南芥CBF3（CRT/DRE binding factor 3）基因为目的基因,应用农杆菌介导的转化法将35SCBF3和rd29ACBF3导入马铃薯（Solanum tuberosum L）鲁引1号块茎,实现其在马铃薯中过量表达得到转基因植株,对其进行了分子生物学的验证及光合生理指标的测定,研究转AtCBF3基因马铃薯对低温的抗性机理。主要结果如下:（1）短期及长期低温处理均导致马铃薯叶片光合速率,光合羧化效率,表观量子效率的下降。转CBF3基因马铃薯叶片降低幅度低于野生型马铃薯,诱导型启动子植株叶片低于组成型启动子植株。（2）低温处理过程中,转CBF3基因马铃薯的最大光化学效率（Fv/Fm）和表观光合量子传递效率（ΦPSⅡ）虽都有所下降,但与野生对照相比,其光抑制抑制程度有较大改善。而转基因株系非光化学猝灭系数（NPQ）高于野生对照,这说明在低温弱光胁迫抑制光合碳同化的情况下,转基因马铃薯叶片的NPQ能够更好地发挥耗散过剩激发能、保护光系统的作用。（3）低温处理过程中,对转CBF3基因马铃薯叶片PSⅡ供体侧、反应中心、受体侧进行分析发现,只有野生型马铃薯植株受到轻微伤害,转基因植株维持较平稳的状态。转CBF3基因马铃薯增强了光抑制后PSⅡ的修复,与转CBF3基因马铃薯体内较高的活性氧清除酶活性和抗氧化物质含量,降低活性氧的积累有关。（4）低温处理条件下,马铃薯叶片中H2O2和O2-的积累增加,野生型马铃薯中H2O2的含量和O2-生成速率大于转CBF3基因马铃薯。转CBF3基因马铃薯植株中可溶性糖和脯氨酸等可溶性物质的含量高于野生型马铃薯。转CBF3基因马铃薯叶片MDA含量和相对电导率比野生型马铃薯低,诱导型启动子植株比组成型启动子植株低。（5）短期及长期低温处理条件下,转CBF3基因马铃薯抗氧化酶活性高于野生型马铃薯,降低膜脂过氧化程度,维持膜的稳定性,减轻了活性氧对PSⅡ的损伤,维持较高的PSⅡ光化学活性,提高PSⅡ对低温抗性。（6）低温处理条件下,转CBF3基因马铃薯叶片卡尔文循环关键酶活性高于野生型马铃薯。低温处理时马铃薯植株碳同化能力快速下降,而PSⅡ只受到轻微伤害是由低温条件抑制了卡尔文循环关键酶活性造成的。（7）低温处理条件下CBF3基因诱导下游某些基因的表达。转CBF3基因马铃薯低温处理时某些抗性基因的表达高于野生型,提高了马铃薯对低温的耐性。（8）与野生型相比较,35S:AtCBF3马铃薯植株受到严重的生长抑制,叶片形状,颜色及块茎的重量发生变化,而rd29A:AtCBF3马铃薯植株的生长抑制现象得到有效缓解。同时,转入CBF3基因后,植株叶绿素含量比野生型植株叶片叶绿素含量增多。

论文目录

• 符号说明
• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 前言
• 1.1 植物对低温的应答
• 1.1.1 抗氧化系统对低温逆境的响应
• 1.1.2 植物细胞应对低温胁迫的渗透调节
• 1.1.3 植物光合机构对低温胁迫的响应
• 1.1.4 低温应答的基因调控
• 1.2 有关CBF 基因家族
• 1.2.1 植物 CBF 基因家族的发现
• 1.2.2 植物CBF 的序列特征
• 1.2.3 CBF 转录因子对COR 基因的表达调控
• 1.2.4 植物CBF 冷应答通路
• 1.3 启动子的类型
• 1.3.1 组成型启动子
• 1.3.2 诱导型启动子
• 1.3.3 组织特异型启动子
• 1.4 研究目的及存在的问题
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料与处理
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 菌株与质粒
• 2.1.3 酶和生化试剂
• 2.1.4 PCR 引物
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 总RNA 的提取
• 2.2.2 PCR 扩增
• 2.2.3 连接反应
• 2.2.4 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 2.2.5 转化及克隆筛选
• 2.2.6 碱法小量提取质粒DNA
• 2.2.7 质粒DNA 的酶切鉴定
• 2.2.8 回收
• 2.3 原核表达载体的构建
• 2.3.1 获得目的基因
• 2.3.2 构建重组表达载体
• 2.3.3 大肠杆菌BL21 原核表达的诱导
• 2.3.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 2.3.5 重组蛋白的纯化
• 2.3.6 原核表达马铃薯CBF3 重组蛋白抗体制备
• 2.4 蛋白杂交分析
• 2.4.1 植物总蛋白的提取
• 2.4.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 2.4.3 半干法蛋白转移
• 2.4.4 封闭及杂交
• 2.4.5 显色反应
• 2.4.6 尿素-SDS-PAGE
• 2.5 农杆菌介导的马铃薯转化
• 2.5.1 侵染用根癌农杆菌的制备
• 2.5.2 马铃薯转化、再生体系的建立
• 2.5.3 培养基配方
• 2.5.4 马铃薯的栽培与繁种
• 2.5.5 转基因马铃薯的鉴定
• 2.6 生理指标的测定
• 2.6.1 光合速率的测定
• 2.6.2 调制式荧光仪荧光参数的测定
• 2.6.3 快速叶绿素荧光诱导曲线的测定
• 2.6.4 丙二醛含量和相对电导率的测定
• 2.6.5 抗氧化酶活性测定
• 2.6.6 叶片中叶绿素含量变化测定
• 2.7 统计分析
• 3 结果与分析
• 3.1 马铃薯CBF3 基因原核表达
• 3.1.1 原核表达载体的构建
• 3.1.2 重组蛋白的表达及诱导条件的优化
• 3.1.3 pET30a-CBF3 重组蛋白的亲和纯化及抗体的制备
• 3.2 马铃薯转化及分子鉴定
• 3.2.1 马铃薯转化
• 3.2.2 转基因植株的分子鉴定
• 3.3 短期低温处理条件下转基因植株的生理指标测定
• 3.3.1 转CBF3 基因马铃薯外部形态的变化
• 3.3.2 低温处理条件下转 CBF3 基因马铃薯叶片光合速率的变化
• 3.3.3 低温处理对PSⅡ相关参数的影响
• 3.3.4 低温处理对MDA 含量和电导率的影响
• 3.3.5 低温处理对AtCBF3 转基因马铃薯的活性氧水平的影响
• 3.3.6 低温处理对转CBF3 基因马铃薯抗氧化酶活性的影响
• 3.3.7 低温处理对转CBF3 基因马铃薯卡尔文循环关键酶活性的影响
• 3.3.8 低温胁迫对烟草叶片脯氨酸和可溶性糖含量的影响
• 3.4 长期低温处理条件下转基因植株的生理指标测定
• 3.4.1 低温处理条件下转CBF3 基因马铃薯叶片光合速率的变化
• 3.4.2 低温处理对Fv/Fm 和ΦPSⅡ 的影响
• 3.4.3 低温处理对转CBF3 基因马铃薯抗氧化酶活性的影响
• 3.5 低温处理对CBF3 马铃薯植株中COR, CAT1, SOD, P5CS 和SuSy 表达情况的RT-PCR 分析
• 4 讨论
• 5 结论
• 参考文献
• 致谢