体细胞核移植胚胎和皮肤成纤维细胞来源干细胞的相关技术研究

论文摘要

背景及目的人胚胎干细胞（embryonic stem cells, ES cells）是一种具多项分化潜能的细胞,可被诱导分化成各种特化细胞和组织,用来修复或替代人体丧失功能的组织和器官,这就是“干细胞治疗（stem cell therapy）”。干细胞治疗在疾病治疗和损伤修复领域中有潜在的优势,它可治疗包括脑、肾脏、骨髓及组织病变在内的多种疾病。但是,由于每个个体的组织相容性不同,同种异体胚胎干细胞用于临床会引起免疫排斥。解决这一难题的主要途径就是产生患者自己的胚胎干细胞。体细胞核移植法（somatic cell nuclear transfer, SCNT）即治疗性克隆（therapeutic cloning）和诱导产生多能性干细胞这两项技术已成功诱导出组织相容的多能干细胞,并且取得了重大进展。治疗性克隆是指将体细胞核移入去核的卵母细胞中,在理论上,体细胞的细胞核将被卵母细胞的胞质重编程,沉默表达体细胞基因同时激活干细胞基因。重构胚发育至囊胚阶段后,从囊胚内细胞团（inner cell mass, ICM）中分离出胚胎干细胞。随后胚胎干细胞发育分化产生携带患者自己基因的胚胎干细胞,这些胚胎干细胞及其衍生组织移植后就不会产生免疫排斥。但是,体细胞核移植技术仍不完善,成功的诱导核移植胚胎干细胞系需要依赖多种因素,包括受体细胞的类型、重编程的时间、激活方法、胚胎的培养系统等。此外,损伤小的重构的方法也是关键因素之一。目前,使用该项技术成功获得克隆囊胚的效率仍然很低。最近,有研究利用异位表达胚胎干细胞标志因子重编程小鼠成纤维细胞,使其产生组织相容胚胎干细胞,为干细胞治疗开辟了新的途径。这类诱导产生的多能干细胞（induced pluripotent stem Cell, iPS）是利用逆转录病毒载体在小鼠成纤维细胞中导入了4个与多能性有关的基因Oct4, Sox2, c-myc和Klf4诱导产生的。得到的iPS细胞在许多方面都与ES细胞十分相似,并且可以产生嵌合体。随后这四个因子又成功诱导人类成纤维细胞重编程为iPS细胞。这一技术的应用对产生组织相容多能干细胞及医学研究有着巨大的价值。但是,c-Myc逆转录病毒的活化增加了嵌合体和子代的致瘤性。此外,诱导产生多能干细胞的效率也不高,阻碍了它的临床应用。因此,为了提高干细胞治疗的效率,深入研究体细胞重编程的分子机制,本课题从体细胞核移植和诱导产生的多能干细胞两个方面研究了多种因素对其效率产生的影响。本论文分为6部分:第1部分不同核移植方法对小鼠体细胞核移植效率的影响目的研究不同核移植方法对小鼠体细胞核移植效率的影响,建立一种简单有效的核移植方法。方法以小鼠颗粒细胞作为体细胞核移植的供核细胞,采用四种去核方法（盲吸法、蔗糖辅助去核法、化学去核法、荧光染色去核法）研究卵母细胞去核率的差异,并比较了胞质内注射法和反向核移植法应用于小鼠体细胞核移植的效果。结果荧光染色法的去核率（88%）显著高于其他试验组（P<0.05）;胞质内注射法的囊胚率和囊胚细胞数较反向核移植高（P<0.05）。结论荧光染色去核法和胞质内注射法构建体细胞核移植胚胎效率较高,可维持胚胎早期发育。第2部分单一和联合化学激活方法对小鼠体细胞核移植胚胎体外发育的影响目的探讨单一和联合化学激活方法对小鼠体细胞核移植胚胎体外发育的影响。方法构建小鼠核移植胚胎。分别使用单一激活剂钙离子载体（A23187）、乙醇（Eth）、氯化锶（SrCl2）及联合蛋白激酶抑制剂6-DMAP、CB激活。结果10mmol/L SrCl2处理6 d可获得较高卵裂率（68.9%）和囊胚率（7.2%）（P<0.05）,也较A23187、Eth组高（P<0.05）;联合激活方法中,Eth+6-DMAP+CB组（69.8%和46.05±2.62）、SrCl2 +CB组（71.9%和45.40±2.23）和A23187+6-DMAP+CB组（62%和39.75±1.15）卵裂率和囊胚细胞计数明显高于未联合组（P<0.05）。结论乙醇联合6-DMAP、CB组合,SrCl2联合CB组合均能较好地激活小鼠体细胞核移植胚胎。第3部分一步法和二步法培养系统对小鼠体细胞核移植胚胎体外发育的影响目的比较一步法和二步法两种培养系统对小鼠体细胞核移植胚胎体外发育的影响,确立一种有效的培养系统。方法构建小鼠核移植胚胎。激活后,随机分为两组。第1组,比较核移植胚胎在KSOMgAA , KSOMgAA / KSOMgAA , cleavage medium and cleavage medium/blastocyst medium中的发育情况;第2组,观察牛黄酸对核移植胚胎发育影响。结果核移植胚胎发育的囊胚率、孵化率和囊胚细胞计数一步法和两步法培养体系中没有显著差异（P>0.05）。牛磺酸加入KSOMgAA后能有效改善早期核移植胚胎体外发育能力。结论一步法和两步法培养体系均符合小鼠体细胞核移植胚胎不同发育阶段需求。第4部分小鼠体细胞核移植囊胚的微卫星DNA鉴定目的利用微卫星DNA技术进行体细胞核移植囊胚的鉴定。方法提取近交系小鼠体细胞核移植囊胚、供体BALB/c小鼠、受体C57BL/6小鼠及昆明小鼠的基因组DNA,使用巢式聚合酶链反应扩增4个微卫星位点DNA片段,即D3Mit28, D11Mit258,D12Mit136及D14Mit50。结果通过微卫星DNA序列的扩增,证明核移植囊胚的微卫星DNA与供体细胞完全相同,而与受体细胞或者对照细胞无亲缘关系。结论体细胞核移植囊胚基因组来源于供体BALB/c小鼠。第5部分体细胞核移植胚胎ES细胞样集落分离目的探讨小鼠体细胞核移植胚胎ES细胞样集落分离和培养方法,比较不同因子对建立核移植胚胎ES细胞样集落效率的影响。方法构建小鼠体细胞核移植胚胎。当核移植胚胎培养至早期囊胚阶段,移至小鼠胎儿成纤维细胞饲养层上,换成ES细胞培养液继续培养4～5d,分离消化ICM,重新接种。2 d后分离出ES样细胞集落,进行形态学观察。结果ES样细胞集落具有典型的形态学特征:集落呈鸟巢状,边缘清楚,表面平滑,结构致密,隆起生长,细胞之间界限不清楚;单个细胞体积小、核大。碱性磷酸酶染色呈阳性。体外可分化为拟胚体,体内可分化成上皮样细胞、腺体和肌肉组织。结论小鼠体细胞核移植胚胎中可以分离出ES细胞样集落。第6部分小鼠成纤维细胞诱导产生多能干细胞目的体外诱导小鼠成纤维细胞重编程为多能胚胎干细胞样集落。方法分别将Pou5f1, Sox2, c-Myc和Klf4真核表达载体转染NIH3T3细胞。分离小鼠成纤维细胞,移至小鼠胎儿成纤维细胞饲养层上,取转染后的上清液培养。3d后,加入G418,筛选克隆2～3w。结果筛选初期大部分克隆形态学为扁平状,仅4株克隆为ES细胞样生长,后期克隆数增长至11株。ES细胞样克隆具有岛屿状团状隆起结构。结论四个逆转录因子Pou5f1, Sox2, Klf4和c-Myc可诱导小鼠体细胞ES细胞集落样改变。

论文目录

• 英文缩略词表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 实验技术路线
• 第一部分 体细胞核移植和诱导产生多能干细胞 研究进展
• 参考文献
• 第二部分 不同核移植方法对小鼠体细胞核移植效率的影响
• 1 材料与方法
• 1.1 主要材料
• 1.1.1 主要仪器
• 1.1.2 主要试剂
• 1.1.3 溶液的配制
• 1.2 实验方法与步骤
• 1.2.1 实验动物
• 1.2.2 小鼠卵母细胞的获取
• 1.2.3 供体细胞的分离和培养
• 1.2.4 细胞的冷冻保存
• 1.2.5 细胞的复苏
• 1.2.6 去核
• 1.2.7 核移植
• 1.2.8 反向核移植法
• 1.2.9 激活和培养
• 1.2.10 统计分析
• 2 结果
• 2.1 不同去核方法对小鼠卵母细胞的去核效率的影响
• 2.2 胞质内注射法和反向核移植的核移植效果比较
• 3 讨论
• 参考文献
• 第三部分 单一和联合化学激活方法对小鼠体细胞核移植胚胎体外发育的影响
• 1 材料与方法
• 1.1 主要材料
• 1.1.1 主要仪器
• 1.1.2 主要试剂
• 1.1.3 溶液的配制
• 1.2 实验方法与步骤
• 1.2.1 实验动物
• 1.2.2 供体细胞的分离和培养
• 1.2.3 体细胞核移植
• 1.2.4 激活
• 1.2.5 培养和细胞计数
• 1.2.6 统计分析
• 2 结果
• 2.1 单一激活方法对小鼠体细胞核移植胚胎体外发育的影响
• 2.2 联合激活方法对小鼠体细胞核移植胚胎体外发育的影响
• 3 讨论
• 参考文献
• 第四部分 一步法和二步法培养系统对小鼠体细胞核移植胚胎体外发育的影响
• 1 材料与方法
• 1.1 主要试剂
• 1.2 实验方法与步骤
• 1.2.1 去核和核移植
• 1.2.2 激活和培养
• 1.2.3 统计分析
• 2 结果
• 2.1 核移植胚胎在一步法和二步法培养系统中的发育情况
• 2.2 牛磺酸对核移植胚胎体外发育的影响
• 3 讨论
• 参考文献
• 第五部分 近交系小鼠体细胞核移植囊胚的微卫星 DNA 鉴定
• 1 材料与方法
• 1.1 主要材料
• 1.1.1 主要仪器
• 1.1.2 主要试剂
• 1.1.3 溶液的配制
• 1.2 实验方法与步骤
• 1.2.1 囊胚的构建
• 1.2.2 引物
• 1.2.3 基因组DNA 的提取
• 1.2.4 巢式PCR 扩增
• 2 结果
• 3 讨论
• 参考文献
• 第六部分 体细胞核移植胚胎 ES 细胞样集落分离
• 1 材料与方法
• 1.1 主要试剂
• 1.2 实验方法与步骤
• 1.2.1 实验动物
• 1.2.2 细胞饲养层的制备
• 1.2.3 囊胚的构建
• 1.2.4 核移植囊胚的培养
• 1.2.5 重构胚中 ES 细胞样集落的培养
• 1.2.6 ES 细胞样集落碱性磷酸酶染色
• 1.2.7 ES 细胞样集落多分化潜能鉴定
• 2 结果
• 2.1 ES 细胞分离培养过程
• 2.2 小鼠核移植重构胚中 ES 细胞样集落的分离培养
• 2.3 ntES 细胞样集落生长状况
• 2.4 ES 细胞 AKP 组织化学染色
• 2.5 体内分化
• 2.6 体外分化
• 3 讨论
• 参考文献
• 第七部分 小鼠成纤维细胞诱导产生多能干细胞
• 1 材料与方法
• 1.1 主要材料
• 1.1.1 主要仪器
• 1.1.2 主要试剂
• 1.1.3 质粒与菌种
• 1.1.4 PCR 引物
• 1.2 实验方法与步骤
• 1.2.1 感受态细菌的制备
• 1.2.2 细胞总 RNA 的提取
• 1.2.3 逆转录为cDNA
• 1.2.4 引物的设计与合成
• 1.2.5 PCR 扩增
• 1.2.6 PCR 产物的回收纯化
• 1.2.7 目的片断和pEGFP-N1 的双酶切
• 1.2.8 分别将酶切产物纯化回收
• 1.2.9 目的片段与载体的连接,转化
• 1.2.10 阳性克隆质粒扩增
• 1.2.11 重组载体的PCR 和双酶切鉴定
• 1.2.12 测序
• 1.2.13 转染
• 1.2.14 小鼠胚胎成纤维细胞和鼠尾成纤维细胞的培养
• 1.2.15 多能干细胞培养
• 2 结果
• 2.1 目的片断电泳
• 2.2 扩增阳性克隆，质粒酶切电泳，测序
• 2.3 转染
• 2.4 多能干细胞样集落生长状况
• 3 讨论
• 参考文献
• 致谢
• 学习期间发表论文