论文摘要
目的最新研究认为,成体干细胞的衰老是生物体衰老的根本原因,因此寻找重新激活衰老干细胞的方法和调控它靶向分化对延缓衰老和防治老年性疾病至关重要。造血干/祖细胞（hematopoietic stem cell / hematopoietic progenitor cell,HSC/HPC）是目前研究最为深入的一种成体干细胞,现已证明,HSC/HPC衰老与机体衰老和多种老年性疾病密切相关。人参是祖国医学重要的“补气”要药,人参皂苷是人参的主要药效成分。研究证明:人参皂苷单体Rg1 （ginsenoside Rgl）是人参抗衰老的活性成分,它有明显延长机体寿命及细胞寿命的作用。迄今尚未见从延缓干细胞衰老角度探讨人参抗衰老机理的报道。本课题将干细胞最新的研究技术与祖国传统医学的抗衰老理论和对干细胞的认识紧密结合起来,采用供体HSC/HPC连续体内移植和HSC/HPC体外衰老模型复制等多种现代生物学研究手段,从体内和体外两条途径系统深入地探讨人参皂苷单体Rg1延缓HSC/HPC衰老的作用及其可能的生物学调控机制。旨在为寻找延缓造血干细胞衰老的方法提供理论指导及实验依据。方法1.免疫磁性分选法（MACS）分离、纯化Sca-1+ HSC/HPC,流式细胞术、免疫荧光染色和台酚蓝染色鉴定分选细胞性质和检测细胞活性;2.三丁基过氧化氢（tert-butylhydroperoxide ,t-BHP）诱导Sca-1+HSC/HPC衰老,构建细胞衰老体外模型,研究Rg1延缓或治疗衰老细胞的体外生物学作用;3.供体Sca-1+HSC/HPC连续移植给受致死剂量辐射的受体鼠,构建细胞复制性衰老体内模型,观查移植后受体鼠30天存活率,脾结节（CFU-S）形成数量、脾脏指数及外周血细胞（WBC、HCT、PLT）等恢复情况,PCR检测脾集落形成细胞及受体鼠骨髓细胞Sry基因表达;研究Rg1延缓或治疗衰老细胞的体内生物学作用;4.衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色、造血祖细胞混合性集落（CFU-Mix）培养、细胞周期测定,观察Sca-1+HSC/HPC体内、外衰老的细胞生物学特征;研究Rg1在延缓或治疗体内、外Sca-1+ HSC/HPC衰老的作用机理;5.Western blotting和荧光定量PCR检测衰老相关基因p16INK4a、p19Arf、p53、p21Cip1/Waf1mRNA及细胞周期调控蛋白P16INK4a、P21Cip1/Waf1、CyclinD1、Cyclin E、CDK4、CDK2表达的改变,观察体内、外模型致Sca-1+HSC/HPC衰老的分子生物学机理;研究Rg1延缓或治疗Sca-1+HSC/HPC衰老与p16INK4a-Rb和p19Arf-p53-p21Cip1/Waf1信号通路和信号分子之间的关系;6.Southern blotting与TRAP-PCR法检测端粒长度和端粒酶活性变化,观察体内、外衰老模型致Sca-1+HSC/HPC衰老及Rg1延缓和治疗Sca-1+HSC/HPC衰老与端粒长度和端粒酶活性变化的关系。结果1.流式细胞术检测显示MACS分选前骨髓单个核细胞（MNCs）Sca-1+细胞百分比为（1.8±1.2）%; MACS分离纯化后Sca-1+细胞纯度可达（87.33±1.25）%。免疫荧光显示分选前MNCs中仅有（2.7±1.4）%细胞表达Sca-1+,MACS分离纯化后有（90.86±1.72）%细胞中达Sca-1+。台盼蓝拒染检测分选的Sca-1+细胞活性为96%～99%。提示分选的Sca-1+细胞有较高纯度和活性。2. 100μmol/L t-BHP作用Sca-1+ HSC/HPC 6h,细胞出现衰老的生物学特征,SA-β-gal染色阳性细胞率提高、G0/G1期细胞比例增高,形成CFU-Mix集落数量减少。Rg1延缓或治疗体外衰老模型的Sca-1+ HSC/HPC后, Sca-1+ HSC/HPC的SA-β-gal染色阳性细胞率下降,G0/G1期细胞比例显著降低,形成CFU-Mix集落数量增多;Rg1延缓衰老组各检测指标均较Rg1治疗组变化明显。3. Sca-1+HSC/HPC连续移植三代,PCR检测显示受体鼠脾集落形成细胞及骨髓细胞Sry基因表达阳性,提示重建受体鼠造血功能的造血细胞来源于雄性供体鼠;随供体Sca-1+HSC/HPC移植次数的增加,受体鼠30天存活率下降,形成CFU-S数量减少,脾指数降低,外周血恢复延缓,Sca-1+HSC/HPC出现细胞衰老特征,即SA-β-gal染色阳性细胞率提高、G0/G1期细胞比例增高,形成CFU-Mix集落数量减少。Rg1延缓或治疗衰老方法处理体内衰老的Sca-1+HSC/HPC后,受体鼠30天存活率提高,外周血WBC、HCT和PLT明显恢复加快,Sca-1+ HSC/HPC的SA-β-Gal染色阳性率降低、G0/G1期细胞比例降低、形成CFU-Mix集落数量增多;Rg1延缓衰老组各检测指标均较Rg1治疗组变化明显。4. t-BHP作用Sca-1+ HSC/HPC 6h,Sca-1+ HSC/HPC p16INK4a、p19Arf、p53、p21Cip1/Waf1mRNA及P16INK4a、P21Cip1/Waf1、CyclinD1蛋白表达增强,Cyclin E、CDK4、CDK2蛋白表达降低。Rg1延缓或治疗体外衰老模型的Sca-1+HSC/HPC后,Sca-1+ HSC/HPC p16INK4a、p19Arf、p53、p21Cip1/Waf1mRNA及P16INK4a、P21Cip1/Waf1、CyclinD1蛋白表达下调,CDK4、CDK2、CyclinE表达上调。5. Sca-1+HSC/HPC连续移植三代,随移植代数增加,移植受体鼠Sca-1+ HSC/HPC p16INK4a、p19Arf、p53、p21Cip1/Waf1mRNA及P16INK4a、P21Cip1/Waf1、CyclinD1蛋白表达增强,CDK4、CDK2、CyclinE蛋白表达水平降低。给予Rg1延缓和治疗衰老处理后,Sca-1+HSC/HPC衰老体内模型的p16INK4a、p19Arf、p53、p21Cip1/Waf1mRNA及P21Cip1/Waf1、P21Cip1/Waf1、CyclinD1蛋白表达下调,CDK4、CDK2、CyclinE蛋白表达上调。6.体内及体外衰老模型中,Sca-1+HSC/HPC端粒长度缩短加速,端粒酶活性下降。Rg1延缓和治疗Sca-1+HSC/HPC衰老体内及体外模型后,其端粒长度缩短减少,端粒酶活性增强。结论1.采用MACS能成功、有效的分离、纯化小鼠Sca-1+HSC/HPC,分离的细胞活性好,纯度高。2. t-BHP能有效诱导Sca-1+HSC/HPC衰老,可用于构建体外HSC/HPC衰老模型。Rg1具有延缓及治疗t-BHP诱导的Sca-1+ HSC/HPC衰老的作用,Rg1延缓衰老比治疗衰老效果更好。3. Sca-1+HSC/HPC连续移植受体三次,能成功构建HSC/HPC体内衰老模型。Rg1具有延缓及治疗连续移植过程中Sca-1+ HSC/HPC衰老的作用,Rg1延缓衰老比治疗衰老效果更好。4. p16INK4a-Rb、p19Arf-p53-p21Cip1/Waf1信号通路在Sca-1+HSC/HPC衰老及Rg1延缓或治疗Sca-1+HSC/HPC衰老中可能发挥重要调控作用。5.端粒长度缩短和端粒酶活性下降可能是Sca-1+HSC/HPC衰老的机制之一;Rg1可能通过激活端粒酶活性和减少端粒长度缩短发挥延缓或治疗Sca-1+HSC/HPC衰老的作用。
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