论文摘要
NK细胞及CD8+T细胞分别是天然及适应性细胞免疫的主要效应细胞。活化的NK细胞或CD8+T细胞具有相似的效应功能:针对靶细胞的细胞毒作用和细胞因子的分泌,其中IFN-γ是活化NK细胞或CD8+T细胞分泌的最常见和最重要的细胞因子。IFN-γ不仅具有直接的抗病毒作用,更能对体内多种细胞（包括淋巴细胞自身）发挥免疫调节和修饰的作用。NKG2D是一种表达于NK细胞、巨噬细胞、CD8+T细胞及γδTCR+T细胞表面的活化受体,由NKG2D启动的信号可直接活化NK细胞和巨噬细胞;对于T细胞,NKG2D提供重要的共刺激信号。MHC-I类链相关分子（MICs）是最早被发现且研究较充分的NKG2D受体的配体。MICs定位于HLA-I类基因区,在MICA-MICG七个成员中,目前认为MICA及MICB是能够被转录翻译的功能基因。作为一种应激的标记分子,MICs广泛表达于处于热休克、氧化应激、感染及恶变的细胞表面,当它被NK/T细胞表面的NKG2D受体识别并结合后,即可启动NK细胞或T细胞介导的免疫应答,最终导致这些“异常”细胞被清除。MICs分子也低水平表达于正常肠上皮细胞、某些内皮细胞及成纤维细胞表面;在单核细胞、某些角质细胞及活化的T细胞胞浆内,也检测到MIC蛋白的表达。正常细胞表面低水平或阴性表达MICs分子,可能是机体的一种自我保护机制。单核细胞是单核-巨噬系统的主要成份。体内单核细胞正常情况下处于免疫静息状态,但在适宜的条件作用下,它可以通过转化为DCs或者分泌大量细胞因子来参与或调节免疫应答。最近研究发现,单核细胞与NK细胞或T细胞之间存在着对话机制,并且淋巴细胞产生的IFN-γ及细胞间的直接接触可能是介导单核细胞与淋巴细胞相互作用的关键环节。但对于IFN-γ在调节单核细胞与淋巴细胞之间对话的具体分子机制,目前仍不清楚。考虑到NKG2D在调控淋巴细胞活化及其在天然免疫及适应性免疫应答之间的重要“桥梁”作用,我们猜测NKG2D受体/配体系统极可能也参与了IFN-γ介导的淋巴细胞/单核细胞之间的对话。虽然HBV特异性T细胞应答是机体清除HBV的关键,但NK细胞在HBV感染早期控制病毒复制及辅助HBV特异性CTLs产生方面也扮演重要角色。HBV慢性感染常常伴有NK细胞数量和功能的下降,另一方面,慢性乙肝患者对外源性IFN-γ治疗呈低反应性。HBV慢性感染的NK细胞功能受损是否与单核细胞与NK细胞间交互互作用障碍有关?IFN-γ对慢性乙肝患者单核细胞是否有正常的免疫调节和修饰作用?也是有待回答的问题。基于以上研究背景和存在问题,我们从以下方面进行了相关研究:1、从健康志愿者PBMCs中分选单核细胞,采用流式细胞术和形态观测的方法检测了细胞因子IFN-γ、TNF-α、IFN-α刺激前后单核细胞形态学变化和有关表型分子CD14、CD1a、CD80、CD83、CD86、HLA-DR的表达变化;2、流式细胞术检测细胞因子IFN-γ、TNF-α、IFN-α对正常PBMCs、分选的原代单核细胞以及单核细胞系U937、THP-1表面MIC表达的影响;3、采用RT-PCR及Western blot检测了IFN-γ刺激前后单核细胞MICs的表达;4、将IFN-γ刺激的单核细胞与异体NK细胞进行共培养,采用流式细胞术检测NK细胞活化标志分子CD69及胞内IFN-γ的表达,同时以51Cr释放试验分析了NK细胞对其靶细胞K562细胞的细胞毒效应,观察单核细胞表面MICs分子及膜结合型IL-15（mIL-15）在NK细胞活化及NKG2D受体维持中的作用;5、采用磁珠活化NK细胞,收集活化NK细胞培养上清,与单核细胞进行培养后,再将单核细胞与自体CD8+CD28-T细胞进行共培养,流式细胞术检测单核细胞MICs及T细胞活化相关分子CD25、CD62L的表达;6、采用流式细胞术及51Cr释放试验检测了IFN-γ刺激的慢性乙肝患者单核细胞与正常人NK细胞共培养后,NK细胞的活化分子CD69及胞内IFN-γ的表达,以及NK细胞对K562细胞的杀伤能力;7、流式细胞检测并比较了IFN-γ刺激后,15例健康志愿者及13例慢性乙肝患者单核细胞表面MICs及mIL-15的表达差异。我们的结果发现:1、IFN-γ能促进单核细胞粘附聚集,单核细胞簇集形成独特的“细胞小岛”样结构,IFN-γ刺激的单核细胞呈梭形或多角形,表面有突起形成;IFN-α有较微弱的促进单核细胞簇集的作用,IFN-α刺激的单核细胞形成较多突起,形似星形;TNF-α对单核细胞形态无明显影响;2、IFN-γ刺激5 day后,单核细胞同时具有DCs及单核细胞表型特征,体现为由CD14+CD1a-CD83-转变为CD14+CD1a+CD83+,但CD14表达水平明显下降,IFN-γ还能促进单核细胞CD80、CD86及HLA-DR的表达;IFN-α也能促进单核细胞CD80、CD83、CD86及HLA-DR的表达,能下调CD14表达,但不能上调CD1a表达,上调CD83的能力较弱;TNF-α对上述分子表达无明显影响;3、RT-PCR及Western blot结果显示,新鲜分离单核细胞组成性表达MICA及MICB的转录体和蛋白,流式细胞检测发现单核细胞表面无或微弱地表达MICs分子;用MICs交叉反应性抗体行流式细胞检测,发现IFN-γ可以选择性上调PBMCs中单核细胞表面MICs表达;以MICA特异性及MICB特异性抗体行流式细胞术及Western blot检测,却发现IFN-γ刺激的单核细胞MICA及MICB表达均无明显上调,提示IFN-γ可能促进单核细胞某种未知的MIC分子表达;细胞因子TNF-α、IFN-α对单核细胞MICs表达无影响;4、IFN-γ刺激的单核细胞能促进异体NK细胞CD69及胞内IFN-γ表达,能增强NK细胞对K562细胞的杀伤效应;单核细胞的这种效应至少部分依赖于IFN-γ上调的MICs分子,因为用抗MICs抗体封闭或用细胞小室阻断细胞接触,可以显著地抑制NK细胞的活化;IFN-γ诱导上调的mIL-15能保护NK细胞免于MICs诱导的NKG2D受体下调;5、活化NK细胞分泌的IFN-γ能促进单核细胞表面MICs及mIL-15表达,单核细胞经活化的NK细胞培养上清作用后,能上调自体CD8+CD28-T细胞CD25表达并下调CD62L的表达,单核细胞表面上调表达的mIL-15有助于维持CD8+CD28-T细胞表面NKG2D的正常水平;6、IFN-γ刺激的慢性乙肝患者单核细胞与正常人NK细胞共培养,不能上调NK细胞的活化分子CD69及胞内IFN-γ的表达,也不能增强NK细胞对K562细胞的杀伤能力;对IFN-γ刺激后,15例健康志愿者及13例慢性乙肝患者单核细胞表面MIC及mIL-15的表达进行流式细胞检测,发现慢性乙肝患者单核细胞MICs及mIL-15阳性率低于健康志愿者（分别为21.10%±5.72%vs 42.61%±15.39%,及12.77%±4.31%vs 28.93%±5.77%）,二者相比有显著性差异（p＜0.01）。我们的实验结果表明,来源于淋巴细胞的IFN-γ对单核细胞有重要的免疫调节和修饰作用。IFN-γ促进单核细胞向成熟DCs分化;IFN-γ选择性上调PBMCs中单核细胞mIL-15及某种未知MIC分子（非MICA或MICB）的表达;单核细胞表面上调的MICs分子能够刺激NK细胞活化;活化NK细胞分泌的IFN-γ作用于单核细胞后,单核细胞又能依赖MICs分子共刺激CD8+T细胞;单核细胞表面同时上调表达的mIL-15能够保护NK细胞或CD8+T细胞免受MICs诱导的NKG2D受体下调;慢性乙肝患者单核细胞对IFN-γ诱导的MICs及mIL-15上调存在应答缺陷,这可能是慢性乙肝患者NK细胞功能低下及IFN-γ疗效不佳的潜在机制。总之,我们的研究描绘了以淋巴源性IFN-γ为信使,以NKG2D受体/配体为桥梁的单核细胞-NK/T细胞间的“对话机制”。
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