论文摘要
目的：1.探讨表皮干细胞（epidermal stem cells, ESCs）潜在亚群及分析其解剖分布特点；2.试图建立ESCs转分化诱导方法,拓展ESCs多向分化潜能；3.明确ESCs体外培养表达谱特征,初步建立ESCs非转基因重编程为诱导的多潜能干细胞（induced pluripotent stem cells, iPSCs）实验体系。方法：1.应用免疫组织化学的方法检测不同解剖部位皮肤组织CD34的表达。利用RT-PCR技术及免疫荧光染色技术,从mRNA及蛋白水平检测包皮来源表皮基底层细胞CD34分子表达情况,并从蛋白水平研究ESC特异性标记β1整合素,p63与CD34双标记的情况。将标本按照年龄分组,应用流氏比较不同年龄组CD34各表位表达的统计学差异。2.采用经典方法富集包皮来源未分化角质细胞（undifferentiatied keratinocytes, UKs）,通过流氏及免疫荧光方法检测UKs特异性标记,评价Epilife培养体系对UKs的生长增殖作用,并通过检测fibroenctin, nestin, c-kit排除可能的其他种类细胞的污染,保证UKs纯度。UKs生长到密度为80%-95%时做为诱导初始细胞,分别采用直接血清诱导法、直接定向诱导培养基诱导法和驯化诱导法进行诱导。检测成脂相关mRNA及油红O染色证实脂肪系列转分化,检测成肌相关mRNA及SMA免疫荧光染色证实肌肉系列转分化,检测成神经相关mRNA水平及nestin,β3-tubulin, GFAP免疫荧光染色证实神经系列转分化。血清诱导包皮来源皮肤组织全层碎块,模拟创伤局部血清渗出条件,免疫荧光检测角质细胞的细胞类型转变。建立小鼠损伤模型,选取不同时间点利用免疫荧光技术检测创伤局部角质细胞细胞类型转变。3mRNA水平检测体外培养ESCs表达谱的动态变化特征（特别是多潜能转录调控关键性调控分子）。通过转染OCT4, SOX2, KLF4, c-Myc转基因手段重编程ESCs,或是体外通过胚胎干细胞培养环境直接诱导ESCs去分化,均通过碱性磷酸酶染色及免疫荧光方法检测多潜能转录分子OCT4, SSEA1, NANOG验证iPSCs的产生,将获得iPSCs样克隆进行拟胚体实验,以证实诱导的iPSCs的多能性。结果：1.我们研究发现,CD34分子三种表位在人的头皮及包皮有所表达,但是在躯干皮中未检测到。这体现CD34分子在不同解剖部位的非均衡性分布。CD34阳性细胞多位于表皮突底部,这是ESCs的居所。免疫荧光结果发现包皮分离表皮基底层细胞中β1整合素及p63阳性细胞要多于CD34表达阳性细胞,并且CD34表达阳性细胞同时表达β1整合素和p63。β1整合素,p63及CD34阳性细胞均随传代,阳性表达率呈现下降趋势。体外培养第6代时,CD34阳性细胞完全消失,只存在少量的β1整合素和p63阳性细胞。另外。我们发现CD34阳性细胞并不随着供体年龄的增加出现显著性变化。2.应用体外细胞驯化诱导策略,能够实现UKs多向分化。包皮来源UKs在Eplife培养体系中处于高增殖、不分化状态。研究发现,UKs直接置于血清或是定向分化培养基中,UKs只是定向分化为表皮细胞。然而,血清按照一定的比例逐渐增量加入到Eplife培养体系中,即血清驯化诱导,可以在3周之内将UKs非定向转分化为平滑肌细胞、肌成纤维母细胞及少量的脂肪细胞及神经细胞。相比之下,系列定向分化培养基与Eplife的联合驯化诱导方案,能够将UKs定向分化为神经细胞、脂肪细胞或是肌肉细胞。血清漂养包皮组织48小时（hrs）,包皮表皮角质细胞转分化为vimentin, FSP阳性细胞。单纯包皮表皮漂养48hrs,表皮基底层细胞能够转分化为SMA阳性细胞。小鼠体内模型动态观察发现创伤修复过程中创缘角质细胞能够转分化为vimentin, FSP阳性细胞,但是始终未见SMA阳性细胞出现。3.体外培养的ESCs确实存在多潜能转录分子OCT4, SOX2, KLF4, c-Myc, NANOG的渗漏表达,这些分子一致性的在3-5天（d）时达到高峰,这与iPSC产生理论之一——转录噪声的理论相一致。流氏检测结果发现体外培养3d的ESCs中确实存在OCT4表达阳性细胞,这进一步证实了iPSC产生原理的另外一个理论——精英细胞学说。选用体外培养3-5d的ESCs进行转基因及非转基因重编程,进入胚胎干细胞培养环境持续观察发现,转基因重编程在体外诱导6d时,出现iPSCs样克隆,非转基因重编程在体外诱导14d时,能够观察到iPSC样克隆,免疫荧光结果显示这些克隆表达多潜能转录分子OCT4, SSEA1, NANOG,同时表达ESCs特异性标记CD29。碱性磷酸酶染色对2种方法重编程的效率进行比较,转基因明显高于非转基因。转基因为0.3％,非转基因为0.00002-0.00015%。另外,体外iPSCs样克隆能够形成拟胚体,提示其具有发育能力。结论：1.在本研究中,我们首次系统性的研究CD34三种表位在不同解剖部位的表达情况,初步显示CD34可能在头皮及包皮组织中代表了ESCs的一个亚群,并且CD34在不同解剖部位存在不均衡性进一步证实了干细胞异质性的特征。2.本部分研究数据显示人的UKs在体外具有多向分化能力。另外,通过小鼠的创伤模型也证实在创伤修复过程中存在角质细胞向间质细胞转变,这些结果提示细胞所处局部微环境是细胞能够转分化,甚至展现多能性的关键。同时,本部分研究也是UKs应用于再生医学的理论基础。3.体外培养ESCs的表达谱特征符合iPSC产生的2个基本原理。我们通过转基因及非转基因的方式均获得iPSCs样克隆。通过初步鉴定结果显示ESCs可能成为非转基因重编程产生iPSCs的首选起始细胞。也是消除iPSCs致瘤性风险,并将其应用于临床的解决办法之一