沉默ABCG2基因逆转多耐药小细胞肺癌细胞对化疗药物的抗药性

论文摘要

研究背景：肺癌是导致人类癌性死亡的首位疾病,全球每年因肺癌死亡人数超过100万,其中80%～90%的患者为非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）,15%-25%为小细胞肺癌（small cell lung cancer, SCLC）,由于小细胞肺癌在肺癌各病理分型中分化程度最低,较早的发生血道转移,因此预后极差。临床上病理确诊为小细胞肺癌的患者,由于对化疗极其敏感,所以采取化疗为主要的治疗方式,但很快就会出现肿瘤耐药,化疗失效,导致小细胞肺癌患者早期出现肿瘤进展、复发、转移,5年生存率不足10%。因此化疗的耐药性是临床小细胞肺癌治疗的最大问题之一,如何减少小细胞肺癌对化疗药物的耐药性是基础、临床工作者亟待解决的关键问题。多药耐药是获得性耐药最重要的一种耐药形式,主要是指对已经接触过抗肿瘤药物无论在功能上或结构上都不相关的多种药物具有获得性耐药。目前认为,肿瘤耐药机制主要有：（1）药理耐药（pharmacological resistance）:指由机体对药物的影响所导致的耐药,如药物进入机体代谢增强或活化障碍,肿瘤血供不足,药物组织亲透力差,药物避难所的形成等；（2）微环境耐药（microenvironment resistance）:是指肿瘤细胞的存活和生长有赖于器官微环境,而器官微环境可以通过不同的耐药基因表达来影响肿瘤细胞对化疗药物的敏感性；（3）凋亡耐药（apoptosis resistance）:如P53、BCL-2、C-myc参与控制的细胞凋亡受抑；（4）生化耐药（biochemical resistance）:指肿瘤细胞的遗传性及生化特性发生复杂的变化,使细胞通过不同途径对药物耐药,其中研究最为广泛的是ABC膜转运蛋白超家族成员,即药物输出泵,如P-糖蛋白（P-gp）,多药耐药相关蛋白（MRP）,肺耐药相关蛋白（LRP）。1998年Doyle LA, Yang W等研究乳腺癌细胞株MCF-7/AdrVp,首先在乳腺癌细胞株中检测到乳腺癌耐药蛋白（breast cancer resistance protein, BCRP）,此蛋白为ATP结合转运蛋白G超家族成员2（ATP2binding cassette super-family G member2,ABCG2）,此蛋白可将化疗药物泵出胞外,使细胞内化疗药物的浓度明显降低,使化疗失败,从而导致肿瘤细胞产生耐药性。我们的前期基因芯片筛选结果表明,在小细胞肺癌耐药细胞株与亲本细胞株,ABCG2的表达有明显的差异。基于ABCG2在小细胞肺癌耐药细胞株与亲本细胞株表达差异,我们推测ABCG2在小细胞肺癌耐药方面起了重要作用,探讨ABCG2在小细胞肺癌细胞耐药性产生的作用,为临床解决小细胞肺癌治疗中极易出现的耐药性问题提供新的理论依据。目的：1.本实验选择小细胞肺癌细胞株H69与其多药耐药细胞株H69AR做为研究对象,分析两细胞株形态学、对化疗药物敏感性的差异。2.分析小细胞肺癌细胞株H69与其多药耐药细胞株H69AR细胞株在mRNA和蛋白水平ABCG2表达的差异。3.运用基因沉默技术将高表达ABCG2的H69AR细胞株中的ABCG2基因沉默后,检测其效果,观察H69AR细胞株耐药性的变化。方法：1.光学显微镜下观察小细胞肺癌细胞株H69与其多药耐药细胞株H69AR二者形态学变化。2.应用CCK8法检测小细胞肺癌细胞株H69与其耐多药耐药细胞株H69AR二者对阿霉素、依托泊甙、顺铂药物敏感性变化。3.应用实时荧光定量PCR、western-blot技术分析两细胞株中ABCG2表达差异。4.经实时荧光定量PCR、western-blot技术证实H69AR细胞中ABCG2的水平明显高于H69细胞后,运用脂质体Lipofectamine2000法将ABCG2-siRNA转染进入H69AR细胞,进行ABCG2沉默,实时荧光定量PCR、western-blot技术检测基因沉默效果。5.CCK8法检测ABCG2沉默后H69AR细胞对化疗药物耐药性变化。结果：1.CCK8法分析显示耐阿霉素耐药细胞株H69AR相对亲本H69细胞对顺铂、依托泊甙有交叉耐药现象,相同浓度顺铂作用于H69细胞和H69AR细胞,抑制率不同；不同浓度,作用于同一细胞,抑制率也不同（F=68.543,P<0.001）。耐药指数为6.05倍。相同浓度依托泊甙作用于H69细胞和H69AR细胞,抑制率不同；不同浓度,作用于同一细胞,抑制率也不同（F=19.964,P<0.001）。耐药指数为11.43倍。2.相对于H69细胞,经实时荧光定量PCR,在mRNA水平耐药细胞株H69AR中ABCG2的表达水平显著升高（95.5倍）。在蛋白水平耐药细胞株H69AR,ABCG2的蛋白也显著增高,差异有统计学意义（t=-4.527 P=0.011）。3.根据ABCG2基因序列设计了三组特异性的针对ABCG2的SiRNA,分别为ABCG2-667、ABCG2-781、ABCG2-979,通过基因沉默技术成功的降低耐药细胞株H69AR的ABCG2的表达水平,并设定未经任何干预的空白组,经实时荧光定量PCR与空白组相比较ABCG2-667组、ABCG2-781组、ABCG2-979组ABCG2mRNA表达为空白组的0.525、0.875、0.620倍.Western-blot灰度值分析结果显示：相对于空白组,ABCG2-667组、ABCG2-781组、ABCG2-979组ABCG2蛋白水平表达为空白组的0.6735±0.0352、0.7227±0.022、0.6821±0.061倍,SiRNA-667的蛋白灰度校正值最小,其沉默效果最好。4.CCK8法结果显示,与空白组、阴性对照组比较,顺铂对沉默后的耐药细胞株H69AR ABCG2-667组抑制率显著增加,具有统计学差异（F=151.91,P=0.000）。CCK8法结果显示,与空白组、阴性对照组比较,依托泊甙对沉默后的耐药细胞株H69AR ABCG2-667组抑制率增加,具有统计学差异（F=13.652,P=0.000）。结论：1.本研究再次证实小细胞肺癌具有多药耐药特性,相对于小细胞肺癌亲本H69细胞株,小细胞肺癌耐药细胞株H69AR, ABCG2水平表达显著增高,基因沉默技术降低了耐药细胞株H69AR的ABCG2水平,经基因沉默后的耐药细胞株H69AR对顺铂、依托泊甙的耐药性显著增加。2.人小细胞肺癌耐药细胞株H69AR耐药性的产生可能与ABCG2表达水平增高密切相关。3.ABCG2可能做为逆转小细胞肺癌耐药性的理想靶点。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 1 材料
• 1.1 主要仪器
• 1.2 实验用细胞株
• 1.3 主要药品和试剂
• 2 方法
• 2.1 细胞的培养
• 2.2 细胞培养
• 2.3 CCK8法检测H69和H69AR的药物敏感性
• 2.4 实时定量PCR（Real time-PCR）在mRNA水平检测ABCG2含量
• 2.5 western-blot步骤
• 2.6 脂质体介导siRNA转染H69AR细胞
• 2.7 统计学处理
• 3 结果
• 3.1 H69AR与H69细胞形态比较
• 3.2 H69和H69AR对交叉耐药性对比分析
• 3.3 QRT-PCR检测H69及H69AR细胞ABCG2 mRNA表达量
• 3.4 H69与H69AR细胞ABCG2蛋白表达差异
• 3.5 SiRNA沉默效果估计
• 3.6 CCK8检测药物敏感性变化
• 4 讨论
• 参考文献
• 中英文缩写词
• 致谢
• 统计学证明