细菌纤维素发酵优化及代谢途径调控

论文摘要

细菌纤维素作为一种理想的新型生物纳米材料,与植物纤维素相比具有高化学纯度、高结晶度、高持水性、良好的生物相容性、可生物降解性以及物理性质可调控性和形状可塑性等独特的性质。在食品、造纸、石油开采、医疗卫生、组织工程、燃料电池等领域有着广泛的应用前景。细菌纤维素的研究和开发应用课题,作为当今新的微生物合成材料的研究热点之一,已引起科学家们的广泛关注。目前,由于细菌纤维素产量和产率低,价格较高,其应用仅局限在一些高附加值产品的制造中,限制了其工业化生产和推广应用。针对当前问题,为了提高其产量,本文应用从水果中分离筛选并经过鉴定的汉氏葡糖醋杆菌,从优化营养源入手,采用正交试验设计及均匀设计两种优化设计方法,对菌株发酵生产细菌纤维素的种子培养基及发酵培养基的诸多营养因素进行了考察和评价,然后应用人工神经网络耦合遗传算法优化得到最佳发酵培养基组成,显著降低培养基成本,有效地提高产物浓度,大大减少繁琐的实验工作量,缩短研究周期;从代谢机理的角度分析细菌纤维素生物合成的调节机制,构建其生物合成的代谢网络模型;并基于该菌株代谢途径,运用现代代谢工程理论及代谢通量、酶学、代谢物组学等分析方法对其发酵代谢规律进行研究,以期找到控制发酵的手段。首先以发酵24h菌浓为考察指标,采用单因素及正交试验得到种子培养基配方为:蔗糖2%,酵母膏0.3%,蛋白胨0.5%,磷酸二氢钾0.2%,硫酸镁0.015%。单因素确定细菌纤维素发酵条件:接种龄为24h,接种量为7%,种子培养摇床转速为150r/min,培养温度为30℃,初始pH值为6.5。运用DPS软件建立正交及均匀设计模型,统计分析发现后者优于前者,可信度更高;通过相关系数及通径系数分析得出葡萄糖和乙醇对产量结果贡献度最大;剩余通径系数为0.2488,表明还有重要的因素影响到细菌纤维素的产量没有被考虑进来。根据培养基成分的个数和优化指标设计神经网络的结构,得到拓扑结构为6-5-1的神经网络模型。该模型平均相对误差为0.2594%,与传统回归模型比较,模型误差更小,具有更好的收敛性能和拟合精度。以此模型为适应度函数,进行遗传算法全局寻优,得到最佳培养基配方为:葡萄糖3.9789%,牛肉膏0.3396%,酵母膏0.1933%,磷酸氢二钠0.2230%,磷酸氢二钾0.4565%,乙醇2.2255%,最优产量为2.915g/L。发酵验证最大产量为2.87g/L,比原始培养基提高了 1.42倍。基于细菌纤维素生物合成途径,建立相关代谢流量平衡模型,对比优化前后代谢流分布,确定提供细菌纤维素产量的可调控关键柔性节点:G6P和Acetate节点;代谢流分析表明适当降低HMP途径流量有利于细菌纤维素的合成,如何控制r2/r5的比值是今后要探讨的重要问题;乙酸的过度积累造成碳源浪费,分析表明副产物的形成可能与条件控制直接相关。对比发酵结果表明继续从培养基入手提高产量可考虑更换碳氮源或者添加某些生长因子继续优化。基于代谢调控节点及途径分析,选取Mg2+、乙酸钠、丙酮酸钠、柠檬酸钠调控代谢途径流量。实验结果表明:添加2g/L柠檬酸钠对细菌纤维素产量影响最大,使之增加了 7%,发酵终止pH值提高到3.66;乙酸产量从5.86g降低到5.22g;对照甘油残余量为0.82g,调控后为0.54g;柠檬酸的积累从对照的1.21g降低到1.113g;丙酮酸残余量为2.41g,高于对照的1.92g。聚类分析结果表明添加柠檬酸钠使发酵的代谢转变更早发生;主成分分析结果表明发酵早期能量代谢及丙酮酸激酶酶活对发酵过程影响较大;酶学分析表明细菌纤维素非直接合成途径主要受控于丙酮酸激酶和丙酮酸脱氢酶。综合分析提出TCA循环弱化理论,确定溶氧、PH值及底物组成是发酵过程的主要限制性因素。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 1.1 细菌纤维素的结构和性质
• 1.1.1 细菌纤维素的结构特征
• 1.1.2 细菌纤维素的理化特性
• 1.2 细菌纤维素的生物合成及调控
• 1.2.1 细菌纤维素的生物合成途径
• 1.2.2 细菌纤维素生物合成酶系统
• 1.2.3 细菌纤维素合成的调控
• 1.3 发酵生产细菌纤维素的影响因素
• 1.3.1 培养基成分
• 1.3.2 发酵条件
• 1.4 细菌纤维素研究进展
• 1.4.1 细菌纤维素生物合成机制方面
• 1.4.2 结构和理化特性方面
• 1.4.3 高产途径方面
• 1.4.4 拓展应用
• 1.5 微生物发酵优化策略
• 1.5.1 优化发酵工艺的传统统计学方法
• 1.5.2 人工神经网络耦合遗传算法的优化策略
• 1.6 代谢研究相关方法
• 1.6.1 代谢通量分析
• 1.6.2 代谢物组学
• 1.7 木课题的立题背景与研究内容
• 1.7.1 立题背景
• 1.7.2 研究内容
• 第2章 细菌纤维素的发酵优化
• 2.1 引言
• 2.2 材料与仪器
• 2.2.1 菌种
• 2.2.2 培养基配方
• 2.2.3 生化试剂
• 2.2.4 主要仪器
• 2.3 试验方法
• 2.3.1 培养方法
• 2.3.2 细菌纤维素的处理
• 2.3.3 分析方法
• 2.3.4 种子培养基优化
• 2.3.5 细菌纤维素发酵条件的确定
• 2.3.6 发酵培养基优化
• 2.4 结果与分析
• 2.4.1 种子培养基优化
• 2.4.2 细菌纤维素发酵条件的确定
• 2.4.3 发酵培养基优化
• 2.5 木章小结
• 第3章 汉氏葡糖醋杆菌发酵产细菌纤维素的代谢通量分析
• 3.1 引言
• 3.2 材料与仪器
• 3.2.1 菌种
• 3.2.2 主要培养基
• 3.2.3 生化试剂
• 3.2.4 主要仪器
• 3.3 试验方法
• 3.3.1 培养方法
• 3.3.2 代谢网络及代谢流平衡模型构建
• 3.3.3 代谢通量分析
• 3.3.4 分析方法
• 3.4 结果与分析
• 3.4.1 代谢通量分析的理论基础
• 3.4.2 细菌纤维素生物合成的代谢网络及代谢流平衡模型构建
• 3.4.3 代谢通量分布及分析
• 3.5 木章小结
• 第4章 汉氏葡糖醋杆菌合成细菌纤维素的代谢途径调控分析
• 4.1 引言
• 4.2 材料与仪器
• 4.2.1 菌种
• 4.2.2 主要培养基
• 4.2.3 主要仪器
• 4.2.4 生化试剂
• 4.3 分析方法
• 4.3.1 代谢调控策略
• 4.3.2 代谢物测定
• 4.3.3 酶活测定
• 4.3.4 生物量测定
• 4.3.5 细菌纤维素的提取及测定
• 4.3.6 数据处理
• 4.4 结果与分析
• 4.4.1 基于途径分析的关键节点代谢调节
• 4.4.2 柠檬酸钠对细菌纤维素发酵过程的影响
• 4.4.3 柠檬酸钠对发酵过程中胞外代谢物的影响
• 4.4.4 柠檬酸钠对发酵过程中关键酶活的影响
• 4.5 本章小结
• 第5章 讨论
• 5.1 发酵优化策略探讨
• 5.2 培养基成分的交互影响作用
• 5.3 代谢通量分析的探讨
• 5.4 细菌纤维素生物合成的代谢调控
• 第6章 结论与展望
• 6.1 结论
• 6.2 创新点
• 6.3 展望
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 攻读硕士学位期间发表的论文