Bowman-Birk型大豆胰蛋白酶抑制剂的分离纯化及性质研究

论文摘要

胰蛋白酶抑制剂广泛存在于动、植物和微生物中,泛指具有抑制胰蛋白酶活性作用的多肽或者蛋白质,能与相应的蛋白水解酶形成一定的动态平衡,调节生命体内许多重要的生命活动。研究表明大豆中至少含有5种胰蛋白酶抑制剂,但目前其中只有库尼兹（Kunitz,KTI）、包曼-伯克（Bowman-Birk,BBI）两种类型抑制剂被分离。对粗BBI的提取研究。首先采用乙醇对BBI进行进取,通过单因素实验确定了比较适宜的乙醇提取条件,包括乙醇浓度40%～80%、液料比（乙醇质量g/干燥脱脂大豆粉质量g）4～6、提取时间30～60min和提取温度30～60℃。然后利用正交试验得出最佳的乙醇提取条件为:乙醇浓度65%,液料比（乙醇质量g/干燥脱脂大豆粉质量g）为5,提取时间60nin,提取温度60℃。乙醇提取后,又采用等电点法,调pH值,Bowman-Birk型大豆胰蛋白酶抑制剂的等电点为4.2,使胰蛋白酶抑制剂在等电点时达到最大沉淀,然后加入丙酮,沉淀溶液中的胰蛋白酶抑制剂。并做单因素实验得出最佳丙酮用量为（丙酮质量g/调pH值后溶液质量g=2）。再进行超滤,选出超滤的各项参数。包括超滤压力60kPa,超滤温度35℃。最后进行真空干燥得出粗BBI晶体。根据Bradford法按最佳乙醇提取条件和最佳丙酮用量以及上述超滤条件测得BBI粗晶体得率为6.1mg/g。根据BAPNA法以Sigma公司BBI为标准品测得BBI粗晶体中BBI的含量为93.7%。对粗BBI纯化的研究。本实验采用DEAE-25离子交换层析和Sephadex G-50凝胶柱过滤,得出的纯品,根据BAPNA法以Sigma公司BBI为标准品测得实验所得纯品纯度为99.8%。采用BAPNA法测定BBI抑制活性,得出BBI的量与吸光度变化值之间的正比变化关系。本课题还对BBI的稳定性做了实验,分别改变影响BBI抑制活性的条件.以得到BBI稳定性方面的数据。对BBI抑制活性影响的因素有温度、pH值、还原剂。分别在不同的温度下处理BBI,同时采用BAPNA法测定BBI抑制胰蛋白酶吸光度变化值。得出BBI的热稳定性。配制不同pH值的缓冲液处理BBI, pH3.0,采用1.0mol/L的甘氨酸-HCl缓冲液;pH4.06.0,采用0.1mol/L的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液;pH7.0,采用0.1mol/L磷酸二氢钠-磷酸二钠盐缓冲液;pH8.09.0采用0.1mol/L的Tris-HCl缓冲液;pH10.012.0采用0.1mol/L甘氨酸-氢氧化钠缓冲液,处理12h观察其抑制活性的变化,然后用pH8.0的缓冲液处理12小时,再观察其抑制活性的变化。pH值的变化对BBI的抑制活性的抑制是可逆的。又通过实验还原剂DTT对BBI的抑制活性的影响得出BBI对还原剂也有很强的稳定性。本实验也对BBI的失活进行了研究。采用超声波法。超声频率为100kHz,在不同的超声时间处理下,测定BBI抑制活性。发现在100kHz的超声处理3min,BBI完全失活。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 蛋白酶抑制剂的分类
• 1.1.1 Kunitz 亚家族
• 1.1.2 PI-I 和PI-II 家族
• 1.1.3 SERPIN B 亚家族
• 1.1.4 BOWMAN-BIRK 亚家族
• 1.2 植物蛋白酶抑制剂的分布
• 1.3 蛋白酶抑制剂的作用机理
• 1.4 植物蛋白酶抑制剂的三大生理功能
• 1.4.1 内源性蛋白酶调节因子
• 1.4.2 抵抗病虫害和病原体侵染
• 1.4.3 植物贮藏蛋白
• 1.5 BBI 在医药领域的应用
• 1.5.1 BBI 的抗癌活性
• 1.5.2 BBI 的辐射保护作用
• 1.6 蛋白酶抑制剂在抗虫方面的研究
• 1.7 饲料工业中的大豆胰蛋白酶抑制剂
• 1.7.1 大豆胰蛋白酶抑制剂毒理作用
• 1.7.2 饲料中大豆胰蛋白酶抑制剂的失活研究
• 1.7.3 物理失活法
• 1.7.4 化学失活法
• 1.7.5 生物化学还原失活法
• 1.7.6 羰氨反应失活法
• 1.7.7 发酵失活法
• 1.7.8 作物育种法
• 1.8 研究的目的与意义
• 1.9 研究的主要内容
• 2 材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 原料
• 2.1.2 试剂
• 2.1.3 试验仪器
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 BBI 粗提物的制备
• 2.3 试验步骤分析
• 2.3.1 乙醇提取
• 2.3.1.1 乙醇浓度的选择
• 2.3.1.2 液料比的选择
• 2.3.1.3 提取温度的选择
• 2.3.1.4 提取时间的选择
• 2.3.1.5 正交实验设计
• 2.3.2 静置
• 2.3.3 调pH 值
• 2.3.4 加丙酮
• 2.3.5 超滤
• 2.3.6 粗BBI 晶体
• 2.4 BBI 的分离纯化
• 2.5 蛋白质浓度测定
• 2.6 BBI 活性测定方法
• 2.6.1 BAPNA 法测定BBI 抑制活性
• 2.6.2 BAPNA 法测定BBI 抑制活性的原理
• 2.7 不同PH 值对BBI 活性的影响
• 2.8 不同温度对BBI 活性的影响
• 2.9 还原剂二硫苏糖醇处理对BBI 活性的影响
• 2.10 BBI 紫外吸收光谱的测定
• 2.11 BBI 钝化的研究
• 2.11.1 超声波失活法
• 3 结果与分析
• 3.1 BBI 粗提最佳条件的确定
• 3.1.1 乙醇浓度对BBI 提取量的影响
• 3.1.2 不同液料比对BBI 提取量的影响
• 3.1.3 提取温度对BBI 提取量的影响
• 3.1.4 提取时间对BBI 提取量的影响
• 3.1.5 优化正交实验
• 3.1.6 丙酮用量的选择
• 3.1.7 超滤用膜的选择
• 3.1.8 超滤压力
• 3.1.9 料液温度对超滤过程的影响
• 3.2 BBI 的纯化
• 3.3 蛋白质浓度的测定
• 3.4 BBI 抑制活性的测定
• 3.4.1 胰蛋白酶抑制剂的量与胰蛋白酶吸光度变化关系
• 3.4.2 实验所得纯化BBI 的量与胰蛋白酶吸光度变化关系
• 3.4.3 粗提BBI 的量与胰蛋白酶吸光度变化关系
• 3.5 不同PH 对BBI 活性的影响
• 3.6 不同温度对BBI 活性的影响
• 3.7 还原剂二硫苏糖醇处理对BBI 活性的影响
• 3.8 BBI 紫外吸收光谱
• 3.9 超声钝化BBI 活性
• 4 讨论
• 4.1 BBI 粗提物的制备
• 4.2 关于超滤条件的选择
• 4.3 BBI 的分离纯化
• 4.4 BBI 活性的测定
• 4.5 BBI 稳定性分析
• 4.6 BBI 失活的研究
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 攻读学位期间发表的学术论文