AsiaⅠ型口蹄疫双效表达载体构建及表达

论文摘要

口蹄疫（Foot-and-mouth disease,FMD）是由口蹄疫病毒引起的一种烈性传染病,严重危害畜牧业生产,对流行国家造成了巨大的经济损失。目前,接种疫苗仍是防治该病的重要手段之一,现有的疫苗接种动物后,虽能诱导免疫动物产生体液和细胞免疫反应,但其在免疫目标动物后,都会有一段时间的有效抗体产生期,即免疫空白期。动物在这一时期若遇到病原微生物的入侵往往会造成疫病流行。为了解决这一问题,本研究以Asia I/JQ株为模板,进行了双效疫苗的探索研究,获得了以下结果:1.用RT-PCR得到针对FMDV基因组5’非编码区的AS片段、P1+2A结构蛋白基因和3C非结构蛋白基因,将P1+2A、3C和AS依次克隆至T载体,测序结果表明,已得到正确的目的基因片段。2.将目的基因AS、P1+2A+3C依次亚克隆到逆转录病毒表达载体pQCXIX的多克隆位点I和Ⅱ中,经酶切、PCR鉴定及测序分析,表明成功构建了FMDV双效表达载体pQC-AS-P1+2A+3C。3.将重组逆转录病毒载体在脂质体介导下转染AmphoPack293细胞,收获经AmphoPack293包装的假病毒,并在Polybrene（聚凝胺）的介导下感染靶细胞BHK-21,RT-PCR检测表明双效表达质粒中的AS在细胞中得到了有效转录;4.经间接免疫荧光检测证实,口蹄疫的P1+2A基因在BHK-21细胞中能稳定持续表达;本试验成功构建了双效表达载体,为Asia I型双效疫苗的研制奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Summary
• 文献综述
• 第一节 口蹄疫研究进展
• 1.1 研究的目的意义
• 1.2 口蹄疫研究进展
• 1.2.1 FMDV 基因组结构和功能
• 1.2.2 口蹄疫的流行及其危害
• 1.2.3 口蹄疫疫苗研究进展
• 第二节 反义核酸技术的研究进展
• 2.1 反义核酸的作用机理
• 2.2 反义核酸技术中寡核苷酸的序列设计
• 2.3 反义核酸技术的应用
• 2.4 反义核酸技术应用中的问题与前景
• 第三节 逆转录病毒载体系统研究进展
• 3.1 逆转录病毒载体
• 3.2 包装细胞系
• 3.2.1 AmphoPack293 细胞系
• 3.3 逆转录病毒表达系统基本原理
• 3.4 逆转录病毒载体系统的应用
• 3.4.1 逆转录病毒载体系统在基因治疗方面的应用
• 3.4.2 逆转录病毒载体在基因表达方面的应用
• 3.5 逆转录病毒载体涉及的问题
• 3.5.1 逆转录病毒载体的安全性问题
• 3.5.2 基因转导的靶向性问题
• 3.5.3 逆转录病毒载体系统的缺陷
• 3.6 逆转录病毒载体系统在基因治疗中前景展望
• 研究报告
• 第一节 Asia I 型口蹄疫病毒双效表达载体的构建
• 1.1 材料
• 1.1.1 病毒、质粒、宿主菌株
• 1.1.2 主要试剂
• 1.1.3 主要仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 引物设计与合成
• 1.2.2 FMDV 总 RNA 的提取
• 1.2.3 目的基因的获得
• 1.2.4 双效表达载体的构建
• 1.3 结果
• 1.3.1 目的基因片段的鉴定
• 1.3.2 目的基因的测序鉴定结果
• 1.3.3 双效表达载体的鉴定
• 1.4 讨论
• 第二节 AsiaI 型口蹄疫双效表达载体在 BHK-21 细胞中的表达
• 2.1 材料
• 2.1.1 主要试剂
• 2.1.2 主要仪器
• 2.2 方法
• 2.2.1 体外转染质粒的制备
• 2.2.2 重组质粒浓度和纯度的测定
• 2.2.3 转染包装细胞Ampho-Pack293
• 2.2.4 假病毒的收获
• 2.2.5 假病毒感染BHK-21 细胞
• 2.2.6 目的基因的整合鉴定
• 2.2.7 目的基因的转录鉴定
• 2.2.8 间接免疫荧光检测P1 基因的表达
• 2.2.9 病毒产生抑制试验
• 2.3 结果
• 2.3.1 转染质粒的浓度及纯度
• 2.3.2 目的基因的整合鉴定
• 2.3.3 RT-PCR 检测AS 转录情况
• 2.3.4 间接免疫荧光检测结果
• 2.3.5 病毒抑制试验
• 2.4 讨论
• 结论
• 参考文献
• 作者简介
• 导师简介
• 致谢
• 附录