枯草芽胞杆菌高产聚-γ-谷氨酸及其应用研究

论文题目: 枯草芽胞杆菌高产聚-γ-谷氨酸及其应用研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 微生物学

作者: 陈雄

导师: 喻子牛,陈守文

关键词: 枯草芽胞杆菌,聚谷氨酸,固体发酵,生物降解,肥料养分吸收促进剂,苏云金芽胞杆菌

文献来源: 华中农业大学

发表年度: 2005

论文摘要: 本文优化了分别以猪粪、奶牛粪为主要原料固体培养专利菌株枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis CCTCC202048）高产聚-γ-谷氨酸（γ-PGA）的工艺,对γ-PGA进行了初步表征,研究了γ-PGA的流变特性和降解特性,探讨了γ-PGA保肥增效的作用和机理,揭示了γ-PGA对生物农药苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt）制剂的保护作用。 应用3个正交试验优化了以猪粪为主要成分固体培养B.subtilis CCTCC202048高产γ-PGA的工艺。优化培养基配方为:猪粪62.3%（w/w,干重）,黄豆饼粉25.0%,麦麸5.0%,谷氨酸5.0%,柠檬酸2.5%,MnSO4·H2O 0.2%;优化培养工艺为:装料量15.0g,含水量60%,对数中期接种,接种量4%,初始pH9.0,培养温度37℃,时间48h。优化试验中,平均γ-PGA产量为6.0%,氨态氮从3.3‰降到0.7‰,全氮、全磷、全钾的变化不明显,速效磷、速效钾的含量略有增加。将优化培养基配方用于野外堆肥试验,γ-PGA的平均产量为4.5%。本研究结果将在减少猪粪的污染,增加猪粪肥效和开发一种新型的保水保肥的有机肥料方面打下坚实基础。 应用响应面方法对以奶牛粪为主要成分固体培养B.subtilis CCTCC202048高产γ-PGA的培养基进行了优化。首先用Plackett-Burman方法对相关影响因素的效应进行了评价,并筛选出了有显著正效应的黄豆饼粉、麦麸和谷氨酸。随后用Box-Behnken实验和响应面分析方法确定了优化培养基配方:奶牛粪56.32%（w/w,干重）,黄豆饼粉23.35%,麦麸16.08%,谷氨酸4.25%;用正交试验优化的最佳发酵条件为:装料量15.0g,含水量60%,对数中期接种,接种量8%,初始pH9.0,培养温度40℃,时间48h。在优化条件下,平均γ-PGA产量为4.98%,氨态氮含量从2.3‰降到0.66‰,全氮、全磷、全钾的变化不明显,速效磷、速效钾的含量略有增加。优化结果与实际发酵情况吻合较好。将最佳培养基配方应用于野外堆肥试验,γ-PGA的平均产量为3.58%。本工艺在奶牛粪的无害化处理、提高奶牛粪肥效、改善有机肥料的保水保肥能力方面有良好的前景。 采用UV、HPLC、FT-IR和NMR等多种测试手段对B.subtilis CCTCC202048代谢产物γ-PGA进行了初步表征。供试样品经水解后,HPLC色谱图出现一个峰,与谷氨酸相同,说明其仅由谷氨酸聚合而成;红外光谱图的特征吸收峰与标准品一致,表明两者具有相同的化学结构,初步确定试验精制产品为γ-PGA。γ-PGA的核磁共振氢谱图进一步说明γ-PGA由谷氨酸组成。 不同浓度、温度和pH值下,对γ-PGA流变特性的研究证明γ-PGA溶液为非牛顿流体,有剪切变稀现象。在20-50℃范围内,粘度随温度的升高呈指数递减,在50-70℃范围内,粘度随温度的升高下降趋势减缓。粘度随γ-PGA溶液浓度增加呈指数形式增加。在pH5-11,粘度较稳定,γ-PGA溶液表观粘度对酸度更为敏感,在

论文目录:

摘要

Abstract

第一章 前言

1.1 γ-PGA的结构和性质

1.1.1 聚-γ-谷氨酸的结构

1.1.2 聚-γ-谷氨酸的性质

1.2 产生γ-PGA的微生物

1.3 γ-PGA合成

1.3.1 γ-PGA合成机制

1.3.2 γ-PGA合成酶基因

1.3.3 γ-PGA合成酶系

1.4 γ-PGA生产工艺

1.4.1 培养基

1.4.2 发酵工艺

1.4.3 提取工艺

1.5 γ-PGA的降解特性

1.5.1 γ-PGA物理降解

1.5.2 γ-PGA化学降解

1.5.3 γ-PGA酶降解

1.6 γ-PGA应用的基础研究

1.6.1 高吸水性树脂的制备

1.6.2 γ-PGA化学改性的研究

1.7 γ-PGA的应用前景

1.7.1 在农业中的应用

1.7.2 在食品与化妆品领域的应用

1.7.3 在医药方面的应用

1.7.4 在环保方面的应用

1.8 课题的研究意义及内容

第二章 以猪粪为主要原料固体发酵枯草芽胞杆菌高产聚-γ-谷氨酸的研究

2.1 前言

2.2 材料和方法

2.2.1 菌株

2.2.2 猪粪

2.2.3 辅料

2.2.4 菌株特性试验

2.2.5 固体发酵培养基

2.2.6 培养方法

2.2.7 正交试验设计

2.2.8 野外试验

2.2.9 γ-PGA的提取

2.2.10 γ-PGA的测定

2.2.11 菌数测定

2.2.12 氮、磷和钾的测定

2.3 结果与讨论

2.3.1 菌株特性

2.3.2 培养基成分的选择

2.3.3 培养基的优化

2.3.4 培养条件的优化

2.3.5 固体发酵过程

2.3.6 野外试验

2.4 结论与展望

第三章 利用响应面方法优化以奶牛粪为主要原料高产聚-γ-谷氨酸的研究

3.1 前言

3.2 材料和方法

3.2.1 菌株

3.2.2 奶牛粪

3.2.3 辅料

3.2.4 固体发酵培养基

3.2.5 固体发酵

3.2.6 Plackett—Burman法筛选影响产γ-PGA的重要因素

3.2.7 Box-Behnken设计对培养基成分的进一步优化

3.2.8 野外试验

3.2.9 γ-PGA的提取

3.2.10 γ-PGA的测定

3.2.11 菌数的测定

3.2.12 氮、磷、钾的测定

3.3 结果与讨论

3.3.1 Plackett—Burman筛选影响产γ-PGA的重要因素

3.3.2 Box-Behnken设计对培养基成分的进一步优化

3.3.3 培养条件的优化

3.3.4 固体发酵过程

3.3.5 野外试验

3.4 结论

第四章 聚-γ-谷氨酸的表征

4.1 前言

4.2 材料和方法

4.2.1 γ-PGA的制备

4.2.2 样品水解与HPLC分析

4.2.3 紫外分析

4.2.4 红外光谱分析

4.2.5 核磁共振分析

4.3 结果与讨论

4.3.1 样品水解与HPLC分析

4.3.2 紫外分析

4.3.3 外光谱分析

4.3.4 核磁共振分析

4.4 结论

第五章 聚-γ-谷氨酸的流变特性

5.1 前言

5.2 材料和方法

5.2.1 γ-PGA的制备

5.2.2 仪器

5.2.3 γ-PGA溶液流变特性的测定

5.2.4 样品粘度值测定

5.2.5 流变特性的分析与计算

5.3 结果与讨论

5.3.1 剪切应力与剪切速率的拟合关系

5.3.2 表观粘度与剪切速率的关系

5.3.3 表观粘度与温度的关系

5.3.4 表观粘度与γ-PGA浓度的关系

5.3.5 pH值对γ-PGA溶液表观粘度的影响

5.3.6 盐对γ-PGA溶液表观粘度的影响

5.4 结论

第六章 聚-γ-谷氨酸的降解特性

6.1 前言

6.2 材料和方法

6.2.1 γ-PGA的制备

6.2.2 γ-PGA的热降解

6.2.3 γ-PGA的酸降解

6.2.4 γ-PGA的碱降解

6.2.5 γ-PGA的超声波降解

6.2.6 γ-PGA在环境水样中的降解

6.2.7 γ-PGA在环境土样中的降解

6.2.8 γ-PGA的微生物降解

6.2.9 γ-PGA的提取

6.2.10 γ-PGA的测定

6.2.11 谷氨酸的测定

6.3 结果与讨论

6.3.1 γ-PGA的热降解

6.3.2 γ-PGA的酸降解

6.3.3 γ-PGA的碱降解

6.3.4 γ-PGA的超声波降解

6.3.5 γ-PGA在环境水样中的降解

6.3.6 γ-PGA在环境土样中的降解

6.3.7 γ-PGA的微生物降解

6.4 结论与展望

第七章 聚-γ-谷氨酸对作物种子活力的影响

7.1 前言

7.2 材料和方法

7.2.1 种子

7.2.2 γ-PGA的制备

7.2.3 种子处理

7.2.4 摆盘发芽

7.2.5 统计计算

7.2.6 淀粉酶活力测定

7.2.7 过氧化氢酶活力测定

7.3 结果与讨论

7.3.1 γ-PGA对种子发芽的影响

7.3.2 γ-PGA对种子芽长的影响

7.3.3 γ-PGA对种子根长的影响

7.3.4 γ-PGA对种子发芽系数的影响

7.3.5 γ-PGA对作物种子淀粉酶活力的影响

7.3.6 γ-PGA对作物种子过氧化氢酶活力的影响

7.4 结论

第八章 聚γ-谷氨酸的保肥增效作用及其机理的初步探讨

8.1 前言

8.2 材料和方法

8.2.1 γ-PGA的制备

8.2.2 水培试验

8.2.3 根系参数的测定

8.2.4 γ-PGA促进营养吸收试验

8.2.5 营养液中营养素的测定

8.2.6 植株养分的测定

8.2.7 盆栽试验

8.2.8 γ-PGA的田间小区灌根试验

8.2.9 发酵猪粪田间小区试验

8.3 结果与讨论

8.3.1 γ-PGA对小白菜产量的影响

8.3.2 γ-PGA对养分吸收的影响

8.3.3 γ-PGA与根冠比的关系

8.3.4 γ-PGA与根活性的关系

8.3.5 γ-PGA对小白菜地上部和根系养分积累的影响

8.4 结论与展望

第九章 聚-γ-谷氨酸对苏云金芽胞杆菌制剂的保护作用

9.1 前言

9.2 材料和方法

9.2.1 γ-PGA的制备

9.2.2 苏云金芽胞杆菌粉剂的制备

9.2.3 紫外线照射

9.2.4 毒蛋白的测定

9.2.5 芽胞数的测定

9.2.6 棉铃虫生物测定

9.2.7 γ-PGA对Bt制剂防护效果的应用试验

9.3 结果与讨论

9.3.1 喷雾干燥加工过程中γ-PGA对研制剂的保护作用

9.3.2 γ-PGA在Bt制剂中的抗紫外线作用

9.3.3 γ-PGA对Bt制剂防护效果的应用试验

9.4 结论与展望

参考文献

致谢

博士在读期间已发表和待发表的论文

发布时间: 2005-12-05

参考文献

• [1].微生物发酵法高效生产γ-氨基丁酸的研究[D]. 赵安琪.江南大学2017

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