论文摘要
研究背景结肠癌是人类最常见的癌症之一,全世界每年大约有60万新增病例,占全部癌症的9%。对于任何希望治愈的结肠癌患者,手术是唯一普遍被接受的治疗措施,约有85%诊断为结肠癌的病人能够通过手术切除病灶,然而在进行手术切除时,有40～70%的病例可发现局部淋巴结转移,并且复发患者中有将近85%的病例预计会在手术切除后3年之内复发。当前所能采用的治疗（如手术、放疗、化疗或生物治疗）对于晚期、转移性病例的总生存率作用不大,转移依然是癌症患者的主要死亡原因。癌细胞通过淋巴管系统扩散到局部淋巴结是多数实体肿瘤播散的首要步骤,动物模型中的实验证实,血管内皮生长因子—C（VEGF-C）可以诱导肿瘤相关的淋巴管生成,并与随之而来的肿瘤淋巴道转移相关。而且,对VEGF-C及其受体VEGFR-3的靶向干预,可以导致肿瘤淋巴管生成的减少和淋巴结转移的降低。这些资料提示VEGF-C及其受体VEGFR-3在瘤淋巴管生成和淋巴结转移中具有重要的作用。虽然有许多分子已被证实与癌细胞的淋巴道转移有关,但是确定结肠癌细胞定向迁移和侵袭进入特定器官的准确机制还有待于阐明。最近有报道指出,肿瘤细胞的迁移和转移受到趋化因子及其受体的严格调控,类似于白细胞的募集。不同的肿瘤细胞表达不同的CC和CXC趋化因子受体,它们相应的配体则常常表达于肿瘤扩散的部位。CXC趋化因子受体-4（CXCR4）可在包括结肠癌细胞在内的许多肿瘤细胞上表达,另一方面,基质细胞衍生因子-1α（SDF-1α）是CXCR4唯一的配体,可促进肿瘤细胞的趋化作用,并在淋巴结上表达。趋化因子受体偶联于异三聚体G蛋白,可诱导癌细胞朝着关联的趋化因子浓度梯度方向移动。新的证据表明,趋化因子受体在转移性肿瘤细胞的归巢中起着关键性的作用。VEGF-C既可以促进淋巴内皮细胞的增生,又可促进淋巴内皮细胞产生趋化因子SDF-1α。当淋巴管和淋巴结组织中的淋巴内皮细胞高表达SDF-1α时,CXCR4/SDF-1α诱导的趋化作用在肿瘤细胞和淋巴内皮细胞之间发挥效应,促使肿瘤细胞锚着于淋巴结,从而使肿瘤细胞更具有侵袭性。一个最近的研究表明,当乳腺癌细胞系和原发性乳腺癌组织CXCR4表达水平较高时,其相应的配体SDF-1α也在病人的肺、肝和骨这些通常的转移部位有高水平的表达,中和SDF-1/CXCR4的相互作用可导致淋巴结和肺转移的显著抑制。但CXCR4在转移中的作用并不局限于乳腺癌,因为CXCR4可在多个其它肿瘤细胞系中表达,并与SDF-1也存在着应答。这些发现强烈支持“归巢理论”的化学性趋化作用,并提示CXCR4/SDF-1α在器官选择性转移的过程中起着关键性的作用。因此,表达于肿瘤细胞上的趋化因子受体CXCR4代表了治疗性干预的潜在靶点。目的1.研究人类结肠癌中SDF-1、CXCR4、VEGF-C、VEGFR-3、Podoplanin的表达特点,以及它们与临床病理参数之间的关系,探索SDF-1、CXCR4、VEGF-C、VEGFR-3、Podoplanin在结肠癌淋巴结转移中的意义。2.研究趋化因子受体CXCR4反义核酸转染导入HT-29和HCT-116细胞系后对其VEGF-C mRNA和VEGF-C蛋白功能性表达的影响,观察CXCR4反义核酸对结肠癌HT-29和HCT-116细胞生长动力学和体外侵袭能力的抑制效应。3.研究CXCR4 RNA干扰对HT-29和HCT-116细胞中VEGF-C mRNA和VEGF-C蛋白表达的抑制作用,评价其对HT-29和HCT-116细胞体外生物学行为的影响。方法1.采用免疫组织化学SP法检测SDF-1、CXCR4、VEGF-C、VEGFR-3和Podoplanin在70例结肠癌标本和12例癌旁正常结肠标本中的表达,统计分析它们与临床病理参数之间的关系。2.构建CXCR4反义核酸的真核表达质粒pcDNA3.1（+）,通过脂质体法将其转染结肠癌HT-29和HCT-116细胞系,采用RT-PCR检测以上2种细胞VEGF-C mRNA的表达,采用Western blot检测以上2种细胞VEGF-C蛋白的表达,同时,采用MTT法了解以上2种细胞的生长情况,采用Boyden小室检测这2种细胞的体外侵袭能力。3.构建靶向CXCR4基因的小干扰RNA（siRNA）,用脂质体将其转入HT-29和HCT-116细胞中,设立转染空载体的同样细胞作为阴性对照,未转染细胞作为空白对照。采用RT-PCR和Western blot检测以上3组细胞VEGF-C mRNA和VEGF-C蛋白的表达,采用MTT法了解以上3组细胞的生长情况,采用Boyden小室检测这3组细胞的体外侵袭能力。通过荧光显微镜观察标记有绿色荧光蛋白的CXCR4基因的表达情况。结果1.60.0%的结肠癌中存在CXCR4蛋白的表达,71.4%的结肠癌中存在SDF-1蛋白的表达,64.3%的结肠癌中存在VEGF-C蛋白的表达,48.6%的结肠癌中存在VEGFR-3蛋白的表达,54.3%的结肠癌中存在Podoplanin蛋白的表达,它们在淋巴结转移组中的表达同非淋巴结转移组中的表达相比,均有显著性差异（88.6%vs.42.3%,75.0%vs.31.0%,79.5%vs.38.5%,63.4%vs.23.1%,72.7 vs.23.1%）,（P＜0.01或P＜0.05）。2.SDF-1.CXCR4,VEGF-C,VEGFR-3和Podoplanin的表达与侵袭深度和淋巴结转移相关（P＜0.01或P＜0.05）,SDF-1的表达还与TNM分期相关（P＜0.05）。然而,它们的表达与年龄、性别、肿瘤大小、组织学类型、分化程度和远处转移均不相关（P＞0.05）。3.在SDF-1与VEGF-C的阳性表达之间（r=0.608,P＜0.05）、CXCR4与VEGF-C的阳性表达之间（r=0.750,P＜0.05）、VEGF-C与VEGFR-3的阳性表达之间（r=0.312,P＜0.01）以及Podoplanin与VEGF-C的阳性表达之间（r=0.425,P＜0.01）均存在着显著的正相关（P＜0.01或P＜0.05）。4.成功构建了CXCR4反义核酸的重组质粒,用脂质体将其转入HT-29和HCT-116细胞后,转染组与对照组相比,对HT-29的VEGF-C mRNA表达抑制率可达64.8%,对HT-29的VEGF-C蛋白表达抑制率可达59.1%;对HCT-116的VEGF-C mRNA表达抑制率可达57.2%,对HCT-116的VEGF-C蛋白表达抑制率可达52.0%;表明结肠癌细胞中趋化因子受体CXCR4的表达与VEGF-C mRNA的表达存在着明显的相关性,通过CXCR4反义核酸技术可以在核酸水平上较大程度地阻断结肠癌HT-29及HCT-116细胞的VEGF-C mRNA及蛋白表达。HT-29细胞antisense-CXCR4转染组的平均穿膜细胞数为61.3±5.8%,而空质粒转染组平均穿膜细胞的百分数为93.7±7.8%,阴性对照组平均穿膜细胞的百分数为95.4±6.9%,转染组与另两组相比有显著性差异（P＜0.05）,而空白对照组与阴性对照组没有显著差异（P＞0.05）;HCT-116细胞的实验结果与此相似,CXCR4反义核酸HCT-116转染组的平均穿膜细胞数为64.6±5.5%,而空质粒转染组平均穿膜细胞的百分数为96.4±7.8%,阴性对照组平均穿膜细胞的百分数为97.3±8.1%,转染组与另两组相比有显著性差异（P＜0.05）,而空白对照组与阴性对照组没有显著差异（P＞0.05）,实验结果表明CXCR4反义核酸转染HT-29和HCT-116细胞后,肿瘤细胞的体外侵袭能力明显降低。5.结肠癌细胞转染pGenesil-CXCR4之后,HT-29细胞VEGF-C mRNA和蛋白表达的抑制率可分别达86.6%和79.2%,与对照组相比差异非常显著（P＜0.01）;HCT-116细胞VEGF-C mRNA和蛋白表达的抑制率可分别达77.4%和71.9%,与对照组相比差异非常显著（P＜0.01）。CXCR4 siRNA转染后HT-29和HCT-116细胞的生长速度比空载体组和未转染组显著降低。HT-29细胞CXCR4 siRNA转染组的平均穿膜细胞数为34.6±5.3%,而空质粒转染组平均穿膜细胞的百分数为93.9±6.4%,阴性对照组平均穿膜细胞的百分数为95.2±5.8%,转染组与另两组相比有显著性差异（P＜0.01）,而空白对照组与阴性对照组没有显著差异（P＞0.05）;HCT-116细胞CXCR4siRNA转染组的平均穿膜细胞数为38.8±4.9%,而空质粒转染组平均穿膜细胞的百分数为97.2±6.5%,阴性对照组平均穿膜细胞的百分数为97.8±7.4%,转染组与另两组相比有显著性差异（P＜0.01）,而空白对照组与阴性对照组没有显著差异（P＞0.05）。HT-29和HCT-116细胞中标记绿色荧光蛋白的CXCR4基因表达在RNA干扰之后显著减少。结论1.SDF-1、CXCR4、VEGF-C、VEGFR-3和Podoplanin的异常表达在结肠癌淋巴道转移中具有重要作用,联合检测SDF-1、CXCR4、VEGF-C、VEGFR-3和Podoplanin的表达可能对预测结肠癌患者的临床分期、转移和预后有帮助。2.结肠癌细胞中趋化因子受体CXCR4的表达与VEGF-C mRNA及蛋白的表达存在着明显的相关性,通过CXCR4反义核酸技术可以在核酸水平上较大程度地阻断结肠癌HT-29及HCT-116细胞的VEGF-C mRNA表达,从而对结肠癌的增殖和转移等恶性表型进行一定程度的逆转。3.构建的CXCR4 siRNA对结肠癌HT-29和HCT-116细胞VEGF-C基因mRNA和蛋白的表达有明显的抑制作用,实验结果提示这种抑制作用具有高度的特异性,可明显降低结肠癌细胞的细胞粘附力、生长速度和体外侵袭能力。4.由于结肠癌淋巴道转移与CXCR4和VEGF-C mRNA及蛋白之间的表达存在正相关,CXCR4的功能状态能够影响结肠癌细胞的趋化作用,因此通过干扰CXCR4和VEGF-C之间的相互作用以阻断结肠癌淋巴道转移可能是一个新的靶点,我们的研究为转移性结肠癌的治疗提供了新的理论基础和实验证据。
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