酶促转化法和微生物发酵法制备S-腺苷甲硫氨酸的研究

论文摘要

S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosyl-L-methionine,SAM）是一种存在于所有活细胞中的重要代谢中间体。在临床上,SAM对肝病、抑郁症、关节炎等疾病有显著的治疗作用,并且易被人体吸收和利用,副作用小。目前,由于在SAM的制备方法中存在:采用酶促转化法不易获得SAM合成酶,采用微生物发酵法SAM纯化工艺复杂、生产周期长等问题,导致了SAM价格昂贵,这严重制约了SAM的广泛应用。针对这一情况,我们分别对制备SAM的酶促转化法和微生物发酵法提出了新的改进策略。我们在毕赤酵母中高效分泌表达了来源于酿酒酵母的重组SAM合成酶,经过酶反应条件的优化,重组酶比活力比从酿酒酵母中提取的SAM合成酶比活力显著提高。通过对该酶性质的详细研究,加强了酶的稳定性。并对此酶实施“一步”纯化-固定化,固定化酶以相对廉价的DL-甲硫氨酸代替L-甲硫氨酸为底物,酶促转化合成SAM。这些研究从理论上进一步增加了对SAM合成酶的认识,为实现酶促转化法的工业应用提供了重要依据。我们诱导重组大肠杆菌,强化表达SAM合成酶,在细胞内以自身底物合成SAM。SAM不仅在胞内得到了积累,而且被大量分泌到培养基中,这对简化SAM的分离、纯化步骤以及缩短生产周期大有帮助。在优化培养条件的过程中,我们发现细胞状态对SAM的胞外分泌有着重要影响。这些实验结果为利用代谢调控的方式提高发酵法制备SAM的生产效率奠定了良好基础。

论文目录

• 提要
• 第一章 绪论
• 第一节 SAM的生物学功能
• 1.1 转甲基作用
• 1.2 转硫作用
• 1.3 转氨丙基作用
• 第二节 SAM的临床应用及其药理研究
• 2.1 SAM的临床应用研究
• 2.1.1 肝病
• 2.1.2 抑郁症
• 2.1.3 关节炎
• 2.1.4 其他
• 2.2 SAM的药理研究
• 2.2.1 肝病
• 2.2.2 抑郁症
• 2.2.3 关节炎
• 第三节 SAM的稳定性研究及其稳定性盐
• 3.1 SAM的稳定性研究
• 3.2 稳定性的SAM盐
• 第四节 SAM的制备方法
• 4.1 化学合成法
• 4.2 微生物发酵法
• 4.3 酶促转化法
• 第五节 SAM合成酶
• 5.1 不同来源SAM合成酶的特点
• 5.1.1 大肠杆菌SAM合成酶
• 5.1.2 酵母SAM合成酶
• 5.1.3 哺乳动物SAM合成酶
• 5.1.4 其它来源的SAM合成酶
• 5.2 SAM合成酶的结构
• 5.3 SAM合成酶的催化机理
• 第六节 甲醇营养型毕赤巴斯德酵母
• 6.1 毕赤酵母表达系统的优势
• 6.2 宿主菌株
• 6.3 表达载体
• 6.4 筛选标记
• 6.5 外源蛋白在毕赤酵母中的表达
• 6.6 外源蛋白在毕赤酵母中的分泌表达
• 6.7 外源蛋白的翻译后修饰
• 第七节 酶的固定化
• 7.1 固定化酶的定义及优点
• 7.2 固定化的载体
• 7.3 固定化的方法
• 7.4 固定化酶的应用
• 本论文的研究意义及主要内容
• 第二章 毕赤酵母分泌表达SAM合成酶及SAM制备
• 第一节 序言
• 第二节 SAM合成酶在毕赤酵母中的分泌表达及纯化
• 2.1 实验材料与仪器
• 2.1.1 菌种和质粒
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 主要仪器设备
• 2.1.4 培养基和主要溶液的配制
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 构建表达质粒
• 2.2.2 转化和筛选高拷贝重组菌
• 2.2.3 SAM合成酶在毕赤酵母中的表达
• 2.2.4 镍离子亲和层析法纯化SAM合成酶
• 2.2.5 细胞密度测定
• 2.2.6 SDS-PAGE检测
• 2.2.7 蛋白质浓度的测定
• 2.2.8 SAM合成酶活力的测定
• 2.2.9 HPLC法定量SAM
• 2.3 实验结果
• 2.3.1 构建表达质粒
• 2.3.2 鉴定重组菌株
• 2.3.3 可能的糖基化位点分析
• 2.3.4 SAM合成酶的分泌表达
• 2.3.5 SAM合成酶的纯化
• 2.3.6 SAM 合成酶的分泌表达量
• 2.4 讨论
• 第三节 SAM合成酶反应条件的优化
• 3.1 实验材料与仪器
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 酶反应进程
• 3.2.2 最适反应温度
• 3.2.3 最适反应pH值
• 3.2.4 酶反应液中底物浓度的优化
• 3.2.5 酶反应液中其它成分浓度的优化
• 3.2.6 以DL-Met取代L-Met
• 3.2.7 其它反应条件对酶活力的影响
• 3.3 实验结果
• 3.3.1 酶反应进程
• 3.3.2 最适反应温度
• 3.3.3 最适反应pH值
• 3.3.4 酶反应液中底物浓度的优化
• 3.3.5 酶反应液中其它成分浓度的优化
• 3.3.6 以DL-Met取代L-Met
• 3.3.7 其它反应条件对酶活力的影响
• 3.4 讨论
• 第四节 SAM合成酶性质的研究
• 4.1 实验材料与仪器
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 动力学性质
• 4.2.2 温度稳定性
• 4.2.3 pH稳定性
• 4.2.4 阳离子、阴离子对酶稳定性的影响
• 4.2.5 防止酶的热失活
• 4.3 实验结果
• 4.3.1 动力学性质
• 4.3.2 温度稳定性
• 4.3.3 pH 稳定性
• 4.3.4 阳离子、阴离子对酶稳定性的影响
• 4.3.5 防止酶的热失活
• 4.4 讨论
• 第五节 SAM合成酶的固定化研究
• 5.1 实验材料与仪器
• 5.2 实验方法
• 5.2.1 SAM合成酶的固定化
• 5.2.2 固定化SAM合成酶以DL-Met为底物合成SAM
• 5.3 实验结果
• 5.4 讨论
• 本章总结
• 第三章 大肠杆菌发酵法制备SAM
• 第一节 序言
• 第二节 实验材料与仪器
• 2.1 菌种和质粒
• 2.2 主要试剂
• 2.3 主要仪器设备
• 第三节 实验方法
• 3.1 构建表达质粒
• 3.2 构建重组菌株
• 3.3 培养重组菌株
• 3.4 细胞密度的测定
• 3.5 SDS-PAGE检测
• 3.6 HPLC法定量SAM
• 3.7 培养条件的优化
• 第四节 实验结果
• 4.1 SAM合成酶的诱导表达
• 4.2 SAM含量的检测
• 4.3 IPTG浓度对SAM浓度的影响
• 4.4 开始诱导时菌体密度对SAM浓度的影响
• 4.5 诱导时间对SAM浓度的影响
• 4.6 培养基中添加（NH4）2504对SAM浓度的影响
• 4.7 培养基中添加 Met 对 SAM 浓度的影响
• 4.8 培养基中添加KCl、MgC12对SAM浓度的影响
• 第五节 讨论
• 本章总结
• 参考文献
• 作者简历
• 博士期间已发表和待发表的文章
• 中文摘要
• 英文摘要
• 致谢