粮谷中的黄曲霉毒素（B1、B2、G1、G2）和赭曲霉毒素A联合检测研究

论文摘要

黄曲霉毒素（AFT）和赭曲霉毒素（OT）是真菌毒素中毒性最大的两类毒素,1993年AFB1被国际癌症研究机构（IARC）列为一类致癌物,赭曲霉毒素中的赭曲霉毒素A （OTA）则被列为二类致癌物。AFT和OT不仅毒性强,而且污染范围极广,AFT对粮食和饲料的危害有不少报道,检出率高达80%～100%,OT则被许多国家检出大量污染粮食作物,更有资料表明AFT和OTA常常同时污染同一粮食作物,而且存在毒性的加性效应,众多国家和地区都已经制定了AFT和OTA严格的限量标准。目前虽然AFT和OTA的分别测定方法已比较成熟,很多学者都做了大量的研究,但其分别测定成本较高,试剂损耗严重且测定耗时,工作量大。而对AFT和OT进行联合检测可有效解决上述问题,缩短分析时间,提高食品安全性。目前对食品、农产品中AFT和OT等真菌毒素的单独检测方法主要有薄层色谱法、酶联免疫吸附法、荧光光度法、胶体金免疫层析法和高效液相色谱法等,但对其进行联合检测的报道较少,虽有少数文献建立了其联合检测方法,但其方法成本高,设备昂贵,不能在一般实验室大面积推广使用,因而受到限制。建立一套成本低,操作简便、快速、净化效果好的AFT和OTA联合检测方法,运用于粮食作物中的真菌毒素检测,意义重大。本研究建立了粮谷中AFT和OTA的联合检测方法,样品采用超声波提取,液液萃取净化,高效液相色谱-可变荧光波长检测器测定。同时对方法的准确度,精密度,灵敏度和线性范围等进行研究,并与现行国标方法进行比对实验,主要结论如下：（1）通过荧光分光光度计在200nm～700nm范围内全波段扫描,AFT的最大激发波长360nm左右,最大发射波长440nm左右；OTA最大激发波长333nm左右,最大发射波长477nm左右。经过高效液相色谱-荧光检测器检测,AFT（衍生后）和OTA在液相色谱上有很强的荧光信号,而且每种毒素荧光信号的峰面积和其对应浓度都有良好的线性关系,线性相关系数都在0.999以上,说明通过液相色谱-荧光检测器联合检测AFT和OTA是可行的。（2）对提取过程中影响提取效果的各个因素进行了研究。确定取样量为5g时,可以满足提取回收率的要求,达到80%以上的回收率,变异系数为10%以内；不同提取方式对固体样品中AFT和OTA提取率影响很大,超声波20℃处理20min时可以基本达到最大提取率,回收率在90%左右,检测时间比国家标准振荡处理缩短了近30min；实验研究了提取剂的浓度,提取比对提取效果的影响,20mL80%甲醇溶液对5g样品的提取率可以达到最大,回收率达到80%以上；当进行液液萃取时,第一次萃取后仍有少量毒素残留在水相中,萃取不完全,回收率低,当二次萃取后回收率显著升高,毒素已基本萃取完全,所以实验中进行多次萃取是必要的。（3）在玉米,大米,小麦三类样品中加标回收率平均为71.73%～115.37%,相对标准偏差为3.00%～9.88%；经连续日间和日内7次精密度实验,相对标准偏差为3.00%～9.30%,根据3倍信噪比的峰响应值,确定AFB1、AFB2、AFG1、AFG2和OTA检出限分别为0.06、0.03、0.18、0.05、0.51μg/kg,上述五种毒素分别在浓度0.05～100.00、0.125～25.00、0.05～100.00、0.125～25.00、0.05～50.00μg/L范围内成线性相关,相关系数r分别为0.9995、0.9996、0.9998、0.9992和0.9998；方法学验证结果表明,AFB1、AFB2、AFG1、AFG2和OTA联合检测结果与现行国标的单独检测方法检测结果无显著性差异（P>0.05）。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 文献综述
• 1.1 AFT和OTA与粮谷类农产品安全
• 1.1.1 AFT和OTA理化性质简介
• 1.1.2 AFT和OTA的毒性
• 1.2 AFT和OTA对粮谷类农产品的污染
• 1.3 AFT和OTA的联合检测方法
• 1.3.1 酶联免疫分析法
• 1.3.2 高效液相色谱法
• 1.3.3 色谱质谱联用分析法
• 1.4 AFT和OTA的限量标准
• 2 绪论
• 2.1 研究的目的和意义
• 2.2 研究范围和内容
• 3 实验材料与方法
• 3.1 主要材料与试剂
• 3.2 主要仪器设备
• 3.3 主要方法
• 3.3.1 AFT和OTA联合检测方法
• 3.3.2 AFT国家标准检测方法
• 3.3.3 OTA国家标准检测方法
• 3.3.4 标准曲线制作方法
• 3.3.5 AFT和OTA最大激发波长和发射波长的确定
• 3.3.6 AFT和OTA联合检测液相色谱条件的建立
• 3.3.7 样品前处理
• 3.3.8 取样量的确定
• 3.3.9 提取方式的确定
• 3.3.10 标准筛目数的确定
• 3.3.11 提取功率的确定
• 3.3.12 提取溶剂的研究
• 3.3.13 提取时间的确定
• 3.3.14 提取温度的研究
• 3.3.15 提取料液比的确定
• 3.3.16 不同净化方式比较
• 3.3.17 萃取次数的确定
• 3.3.18 回收率实验
• 3.3.19 精密度实验
• 3.3.20 线性范围及检出限
• 3.3.21 方法学验证
• 3.3.22 实际样品的测定
• 4 研究结果与分析
• 4.1 激发波长和发射波长的选择
• 4.3 取样量对毒素提取率的影响
• 4.4 提取方式对回收率的影响
• 4.5 标准筛目数对提取效果的影响
• 4.6 提取温度、功率和料液比对毒素提取效果的影响
• 4.7 提取溶剂对提取结果的影响
• 4.8 提取时间对提取结果的影响
• 4.9 不同净化方式比较结果
• 4.10 萃取对提取结果的影响
• 4.11 回收率实验结果
• 4.12 精密度实验结果
• 4.13 线性范围及检出限
• 4.14 方法学验证结果
• 4.15 实际样品测定结果
• 5 结论与讨论
• 5.1 主要结论
• 5.2 讨论
• 5.3 创新点
• 参考文献
• 致谢
• 在学期间发表的文章