![轮状病毒P[2]G3株和P[8]G1株对Vero细胞的适应性培养及灭活研究](https://www.lw50.cn/thumb/64f53ac2e1b2685a068ba2ab.webp)
论文摘要
轮状病毒（rotavirus,RV）是世界范围内引起婴幼儿重症腹泻最主要的病原之一,也是造成发展中国家儿童死亡的重要原因,占所有肠道感染病因的50%以上。RV属于呼肠孤病毒科,按其结构蛋白VP6抗原性不同可分为A～G7个组。A组主要感染婴幼儿,现有的RV疫苗也是针对A组开发的。轮状病毒腹泻已经成为严重的公共卫生问题,给社会带来沉重的疾病负担和经济负担。目前尚无治疗该腹泻的特效药物,而且水质和卫生条件的改善并不能明显降低轮状病毒腹泻的发病率。因而开发高效、安全、廉价的病毒疫苗是预防、控制轮状病毒感染的唯一可行办法。世界卫生组织（WHO）对轮状病毒疫苗的研究开发给予了高度重视。现阶段临床中使用的RV疫苗均是口服减毒的活疫苗,在易感人群中取得了很好的免疫效果和保护作用。但因其存在返祖、阳转的危险及潜在的严重副反应（肠套叠）,已不再被看作疫苗研究的主流。一批新型疫苗的研究正处于动物模型实验阶段,如亚单位疫苗、病毒样颗粒（VLP）、灭活疫苗、DNA疫苗和转基因植物疫苗。这些肠道外疫苗虽尚未到达临床观察阶段,但在动物模型中都有一定的保护效应,显示出潜在的应用价值。其中灭活疫苗因其安全性好、稳定性高等优点,日益成为RV疫苗研究的热点。本研究将蚀斑筛选、纯化得到的RV两个血清型P[2]G3株（SA11株）和P[8]G1株（Wa株）适应培养至Vero细胞,以满足利用微载体技术规模化培养病毒的需要。在连续传代的过程中,确定了病毒接种的最佳感染复数（multiplicityof infection,MOI）为0.05;并绘制出病毒在Vero细胞上的增殖曲线,结果显示:病毒接种后第3～4d,感染性滴度达最大值:SA11株（第9代）为7.0 CCID50/ml,Wa株（第9代）为6.25 CCID50/ml,之后滴度有所回降。两株病毒经连续传代均可获得较高的感染性滴度:SA11株（第10代）为7.25 CCID50/ml左右,Wa株（第10代）为6.5 CCID50/ml左右。通过病毒基因组RNA聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）鉴定,两株轮状病毒在传代过程中保持了一致的核酸带型,具有良好的遗传稳定性。利用Vero细胞微载体技术规模化培养轮状病毒,病毒收获液的滴度比静置培养时略高:SA11株（第9代）为7.25 CCID50/ml,Wa株（第9代）为6.75 CCID50/ml。使用β-丙内酯、甲醛以及加热的方法对收获的病毒液进行灭活,灭活后在MA104细胞上盲传3代检测灭活效果,仅MA104细胞培养的SA11株和利用Vero细胞微载体技术规模化培养的SA11株在56℃水浴加热30min后加入1:4000（v/v）β-丙内酯4℃搅拌8d的灭活样品被彻底灭活,电镜下可见完整的病毒颗粒。用Sepharose 4FF凝胶过滤柱纯化Wa株病毒浓缩液,经SDS-PAGE和Western blot检测分析,280nm处第一峰即为纯化病毒峰,Bradford法测定病毒纯化样品的蛋白浓度为0.788mg/ml。本研究成功将轮状病毒两个血清型SA11株和Wa株适应培养至Vero细胞,并通过微载体技术规模化培养轮状病毒,获得了较高的感染性滴度。初步探索了病毒灭活和纯化的工艺,为日后轮状病毒灭活疫苗的研究和开发打下了一定的基础。