海参溶菌酶基因的克隆及结构分析

论文摘要

溶菌酶（lysozyme）又称胞壁质酶（muramidase），是天然非特异性免疫物质，具有强力杀菌作用，广泛存在于各种植物、动物和微生物中。本论文运用了一种以PCR为基础的快速克隆全长cDNA的方法。该方法利用简并RT-PCR结合cDNA末端快速扩增（RACE）法，可直接获得目的基因的全长序列，避免了复杂的构建、筛选cDNA文库的过程。根据以海星、海胆等棘皮动物溶菌酶基因、类溶菌酶基因及其他多种无脊椎动物的溶菌酶保守序列为参考，设计简并引物，通过RT-PCR技术从海参中获得了222bp的cDNA片段。根据已知的片段序列设计引物，利用3’RACE和5’RACE技术扩增未知片断，通过测序、拼接获得海参溶菌酶基因cDNA全长713bp，该基因在GenBank中登录号为EF036468。序列分析表明，该基因cDNA包含一完整开放阅读框，编码145个氨基酸，在3’端的非编码区中有真核基因polyA加尾信号序列AATAAA的出现。该基因含有246bp的5’非编码区和29bp的3’非编码区。推测的溶菌酶分子量为13.8kDa，理论等电点为7.63。序列比对发现与海参溶菌酶基因的推测氨基酸序列相似性较高的26条全是其它物种的溶菌酶序列，而且与欧洲海星（Asterias rubens）的相似性最高，可达72%。以海参基因组DNA为模板进行特异引物的PCR扩增，得到海参溶菌酶基因的全长DNA序列，与海参溶菌酶基因cDNA序列比较发现，海参溶菌酶基因的全长DNA序列有一个长度为1139bp的内含子。以海参为材料提取基因组DNA，以DNA为模板进行特异引物的PCR扩增，扩增产物经克隆测序、酶切位点分析后用作Southern杂交的探针。用限制性内切酶BamH I、EcoR I和Xho I消化基因组DNA，经0.8%琼脂糖凝胶电泳后，利用向上毛细血管转移法将DNA转移到带正电荷的尼龙膜上。地高辛标记探针，在杂交箱中杂交。BamH I和Xho I酶切产物出现了一条杂交带，表明溶菌酶基因在海参基因组中是单拷贝。以海参为材料提取总RNA，以总RNA为模板进行特异引物的RT-PCR扩增，扩增产物经克隆测序后用作Northern杂交的探针，探针用DIG-PCR扩增标记，总RNA经1.0%琼脂糖变性凝胶电泳后，利用向上毛细血管转移法将总RNA转移到尼龙膜上，在杂交箱中杂交。结果目标基因没有杂交信号，表明目标基因表达量很低。经比对发现，海参溶菌酶的推测氨基酸序列具有i型溶菌酶高度保守的两个活性位点（E34和S50）和特有的氨基酸保守序列MDVGSLSCG（PY）（YF）QIK，因此推测海参溶菌酶是i型溶菌酶。对海参溶菌酶的推测氨基酸序列进行蛋白保守结构域数据库分析，结果显示它有一个医用水蛭失稳酶（Destabilase）的蛋白保守结构域；推测氨基酸序列的三级结构分析表明与医用水蛭失稳酶三级结构也极其相似；将海参溶菌酶序列与失稳酶、已知的具有溶菌酶和异构肽酶活性的双功能酶进行比对，发现异构肽酶的活性位点在海参溶菌酶中具有保守性（S81和H117）；因此推测海参溶菌酶是一个双功能酶，它兼具溶菌酶和失稳酶特性，即兼有糖苷酶和异构肽酶活力。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 溶菌酶的研究进展
• 1.1.1 溶菌酶的分类
• 1.1.1.1 c 型溶菌酶（chicken type lysozyme）
• 1.1.1.2 g 型溶菌酶（goose type lysozyme）
• 1.1.1.3 噬菌体溶菌酶（phage lysozyme）
• 1.1.1.4 植物溶菌酶（plant lysozyme）
• 1.1.1.5 真菌与细菌溶菌酶（fungus and bacterial lysozyme）
• 1.1.1.6 无脊椎型溶菌酶（invertebrate lysozyme）
• 1.1.2 溶菌酶的催化作用
• 1.1.2.1 溶菌酶的作用机制
• 1.1.2.2 溶菌酶催化活性的影响因素
• 1.2 溶菌酶的生物学功能
• 1.2.1 溶菌酶在身体防御机制方面的作用
• 1.2.2 溶菌酶与其它生物活性酶的联系
• 1.2.3 溶菌酶与免疫促进物质的联系
• 1.2.4 溶菌酶的消化作用
• 1.3 溶菌酶的应用
• 1.3.1 溶菌酶在食品工业中的应用
• 1.3.1.1 溶菌酶在乳制品中的应用
• 1.3.1.2 溶菌酶在新鲜海产品、肉类制品中的应用
• 1.3.1.3 溶菌酶在低度酒类和饮料中的应用
• 1.3.1.4 溶菌酶在水果保鲜上的应用
• 1.3.1.5 溶菌酶在其他食品中的应用
• 1.3.2 溶菌酶在医学上的应用
• 1.3.3 溶菌酶在多种疾病诊断方面的应用
• 1.3.4 溶菌酶在基因工程和酶工程上的应用
• 1.3.5 制备细胞浸提物
• 1.3.6 溶菌酶在降解壳聚糖上的应用
• 1.3.7 溶菌酶在饲料中的应用
• 1.4 溶菌酶与棘皮动物的防御机制
• 1.5 海洋生物溶菌酶研究动态
• 1.5.1 i 型溶菌酶分子水平研究
• 1.5.2 海洋生物溶菌酶基因工程的研究
• 1.5.3 双功能的 i 型溶菌酶—Destabilase-lysozyme
• 1.6 本文的主要研究内容
• 第二章 材料与方法
• 2.1 海参溶菌酶基因的克隆
• 2.1.1 材料与试剂
• 2.1.1.1 菌种和质粒
• 2.1.1.2 材料
• 2.1.1.3 各种酶类
• 2.1.1.4 试剂盒与试剂
• 2.1.1.5 常用储液
• 2.1.2 方法与步骤
• 2.1.2.1 海参肠总 RNA 的提取与纯化
• 2.1.2.2 溶菌酶 cDNA 保守区域的 RT-PCR 扩增
• 2.1.2.3 海参溶菌酶基因 cDNA5’末端的克隆
• 2.1.2.4 海参溶菌酶基因 cDNA3’末端的克隆
• 2.1.2.5 海参溶菌酶基因全长 DNA 的扩增
• 2.2 海参溶菌酶基因的 southern 和 northern 杂交
• 2.2.1 材料与试剂
• 2.2.1.1 动物材料
• 2.2.1.2 Southern 杂交所需溶液及物品
• 2.2.1.3 Northern 杂交所需溶液及物品
• 2.2.2 方法
• 2.2.2.1 Southern 杂交
• 2.2.2.2 Northern 杂交
• 2.3 用生物信息学方法对海参溶菌酶基因序列特征进行分析
• 第三章 结果与分析
• 3.1 海参肠总 RNA 和基因组 DNA 的质量分析
• 3.1.1 总 RNA 的质量分析
• 3.1.2 基因组 DNA 的质量分析
• 3.2 海参溶菌酶基因克隆
• 3.2.1 海参溶菌酶基因 CDNA 的克隆
• 3.2.1.1 海参溶菌酶基因保守区域 CDNA 的克隆
• 3.2.1.2 海参溶菌酶基因 CDNA5’末端的克隆
• 3.2.1.3 海参溶菌酶基因 CDNA3’末端的克隆
• 3.2.2 海参溶菌酶基因全长 DNA 的克隆
• 3.2.2.1 海参溶菌酶基因 DNA 片段 HS1-d1 的克隆
• 3.2.2.2 海参溶菌酶基因 DNA 片段 HS1-d2 的克隆
• 3.2.2.3 海参溶菌酶基因 DNA 片段 HS1-d3 的克隆
• 3.3 海参溶菌酶基因序列分析
• 3.3.1 海参溶菌酶基因保守区域 cDNA 片段的序列分析
• 3.3.2 海参溶菌酶基因 cDNA 全长序列的分析
• 3.3.3 海参溶菌酶基因内含子分析
• 3.3.4 同源性比较和分子发育分析
• 3.3.5 海参 i 型溶菌酶三级结构模型
• 3.4 Southern 杂交结果与分析
• 3.4.1 海参基因组 DNA 的提取
• 3.4.2 酶切结果分析
• 3.4.3 Southern 杂交检测溶菌酶基因的拷贝数
• 3.5 Northern 杂交结果与分析
• 3.5.1 DIG-PCR 扩增标记探针的检测
• 3.5.2 RNA 变性凝胶电泳分析
• 3.5.3 Northern 杂交对海参溶菌酶基因表达量的检测
• 第四章 讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录