Importin 13与Arx相互作用的研究

论文摘要

生物大分子的核质转运是由受体importinβ蛋白家族成员介导完成的。importin 13（imp13,或者lg12、IPO13）是importinβ蛋白家族的一个成员,它的表达和功能是受发育调节。Northern Blot和免疫组化实验均表明IPO13在脑的表达水平比其他组织都高。imp13是目前所知的哺乳动物细胞中唯一具有双向转运功能的受体蛋白。为了进一步研究imp13的功能,在本研究中,我们用羧基末端imp 13（aminoacid 307-963）（C-imp13）作为诱饵蛋白,用酵母双杂交系统筛选人胚胎脑cDNA文库中能够与其相互作用的蛋白,发现Arx蛋白质能与羧基末端imp 13相互作用。为了确定这个相互作用,我们构建了能表达带有GST和His6标签的全长Arx的原核表达质粒。通过GST pull-down和免疫共沉淀实验,我们发现,像C端Arx与imp13相互作用一样,全长Arx也能与imp13（外源和内源）相互作用。由于imp13能够与Arx相互作用,我们推测Arx有可能是imp13的入核底物。Arx（Aristaless-related homeobox）蛋白是成对同源结构域蛋白家族的一个成员。ARX基因的突变和多种X—连锁的疾病有关。研究发现Arx对前脑,胰腺和睾丸的发育起重要作用。为了进一步研究Arx蛋白的功能,我们构建了表达Arx-GST融合蛋白质的表达载体pGEX4T2-F-Arx。F-Arx蛋白纯化后做抗原,免疫兔子,血清经纯化和验证后,获得了Arx多克隆抗体。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1.前言
• 1.1 蛋白质入核机制的研究
• 1.1.1 大分子物质核质转运及的本过程
• 1.1.2 importin13的结构与功能的介绍能
• 1.2 Arx的研究进展
• 1.2.1 ARX基因和Arx蛋白
• 1.2.1.1 ARX基因的发现
• 1.2.1.2 ARX基因
• 1.2.1.3 ARX基因的表达方式
• 1.2.1.4 Arx蛋白结构
• 1.2.2 Arx蛋白的生物学功能
• 1.2.2.1 ARX在脑发育中的作用
• 1.2.2.2.1 ARX在细胞增殖中的作用
• 1.2.2.2.2 ARX在区域化中的作用
• 1.2.2.2.3 ARX在正切方向神经迁移中的作用
• 1.2.2.2.4 ARX在辐射迁移中的作用
• 1.2.2.2 ARX在细胞分化中的作用
• 1.2.2.3 ARX在胰腺发育中的作用
• 1.3 研究的目的和意义
• 2.实验材料和实验方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 抗体列表
• 2.1.2 细胞列表
• 2.1.3 药品和试剂列表
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 酵母双杂交实验
• 2.2.1.1 醋酸锂法转化DNA入酵母
• 2.2.1.2 酵母样品收集
• 2.2.1.3 酵母培养基配制
• 2.2.1.4 酵母双杂交
• 2.2.1.4.1 SD选择性培养基中3-AT浓度的确定:
• 2.2.1.4.2 酵母菌株贮存和复苏
• 2.2.1.4.3 酵母双杂交步骤
• 2.2.1.4.4 β-半乳糖苷酶（β-galactosidase）活性的检测
• 2.2.1.4.5 从酵母菌中提取质粒
• 2.2.2 质粒提取和转化
• 2.2.2.1 质粒试剂配制
• 2.2.2.2 SDS碱裂解小量制备质粒法
• 2.2.2.3 大规模质粒DNA的提取
• 2.2.2.4 感受态细胞的制备
• 2.2.2.4 DNA转化
• 2.2.3 质粒构建实验
• 2.2.3.1 诱饵质粒的构建
• 2.2.3.2 pGEX-4T-2-F-Arx和PET-28（a+）-F-Arx的构建
• 2.2.4 生化实验
• 2.2.4.1 Western Blot（免疫印迹分析）
• 2.2.4.2 蛋白质的表达和纯化
• 2.2.4.2.1 目的蛋白的大量表达
• 2.2.4.2.2 Arx-GST蛋白的纯化
• 2.2.4.2.3 Beads的回收
• 2.2.4.3 蛋白质浓度测定方法
• 2.2.4.4 抗体的制备
• 2.2.4.5 血清中ARX抗体的纯化
• 2.2.5 细胞相关实验
• 2.2.5.1 细胞培养有关试剂的配制
• 2.2.5.2 胞培养基本操作流程
• 2.2.5.2.1 换液
• 2.2.5.2.2 传代
• 2.2.5.2.3 细胞计数
• 2.2.5.2.4 接种细胞
• 2.2.5.2.5 瞬时转染
• 2.2.5.2.6 裂解细胞
• 2.2.6 GST-pull down
• 2.2.8 免疫共沉淀
• 3.实验结果
• 3.1 酵母双杂交
• 3.1.1 酵母双杂交分析
• 3.1.1.1 pGBKT7-BD-C-imp13的构建
• 3.1.1.2 pGBKT7-C-imp13-AH109的表达
• 3.1.1.3 生长曲线测定pGBKT7-C-IPO13的毒性
• 3.1.1.4 自激活测试
• 3.1.1.5 筛选人胚脑cDNA文库
• 3.2 体内体外实验进一步验证相互作用
• 3.2.1 免疫共沉淀验证相互作用
• 3.2.2 GST-Pull down进一步验证相互作用
• 3.3 ARX抗体制备及纯化
• 3.3.1 构建获得重组质粒pGEX4T2-F-Arx,pET28（a+）—F-ARX
• 3.3.1.1 F-Arx DNA片段的扩增
• 3.3.1.2 构建获得重组质粒pGEX4T2-F-Arx,pET28（a+）—F-ARX
• 3.3.1.3 表达和纯化pGEX4T2-F-Arx,表达pET28（a+）—F-ARX
• 3.3.2 抗血清的纯化
• 4.讨论
• 参考文献
• 致谢
• 附件:在校期间的研究成果