牛成纤维细胞系的建立、体外受精及核移植的研究

论文摘要

本实验重点是在新建胚胎实验室建立牛成纤维细胞培养技术体系和核移植技术体系,完善和熟化体外受精技术体系。并为优秀公牛遗传资源的保存,试管牛和廉价胚胎生产以及转基因牛的研究打下基础。研究结果表明:1.采用组织块贴壁法建立了优秀奶牛种公牛耳组织成纤维细胞系。细胞冻存代数在3-4代,冻存密度达到1×106个/ml以上;复苏后细胞存活率不存在差异,均保持在90%以上;成纤维细胞生长曲线呈“S”型;细胞系微生物检测结果均为阴性,未受到细菌和支原体污染。2.完善与熟化了牛体外受精技术体系。采集卵母细胞547枚,进行受精胚胎和孤雌胚胎的发育及发育速度的比较。体外受精卵的卵裂率（69.8%）、8细胞率（47.3%）和囊胚率（26.1%）低于对照组孤雌胚胎的卵裂率（73.0%）、8细胞率（49.2%）和囊胚率（32.6%）。二者的胚胎发育都在第6d开始有囊胚出现,集中在第6d、7d和8d。而且实验发现,卵丘-卵母细胞复合体中的卵丘细胞能将体外受精胚胎囊胚发育率由10.2%提高到27.5%,在培养液中添加Vero细胞,能将体外受精胚胎囊胚发育率由12.4%提高到27.5%,卵丘-卵母细胞复合体中的卵丘细胞及以Vero细胞作为饲养层细胞能明显提高体外受精胚胎囊胚发育率。3.建立了牛体细胞核移植技术体系。牛体细胞核移植的卵裂率（72.4%）、8细胞率（38.8%）和囊胚发育率（11.2 %）低于对照组卵母细胞孤雌激活的卵裂率（78.8%）、8细胞率（55.3%）囊胚发育率（34.9%）。两组的卵裂率无显著差异,但8细胞率和囊胚发育率的差异显著。在培养液中添加Vero细胞,能将克隆胚胎囊胚发育率由0%提高到11.2%,明显提高胚胎囊胚发育率,能够为实验室提供可移植的胚胎。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 前言
• 1.1 动物体外细胞培养技术发展概述
• 1.1.1 动物体外细胞培养技术的建立
• 1.1.2 动物体外细胞培养的特点
• 1.1.3 动物体外细胞培养的过程
• 1.1.4 动物细胞生物学特性研究
• 1.2 牛体外受精的研究进展
• 1.2.1 牛体外受精研究简史
• 1.2.2 受精作用机制
• 1.2.3 影响牛体外受精的因素
• 1.3 哺乳动物核移植的研究进展
• 1.3.1 动物体细胞核移植研究进展
• 1.3.2 牛体细胞核移植研究进展
• 1.4 本研究的目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 仪器设备及耗材
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 主要试剂的配制
• 2.2 方法
• 2.2.1 种公牛耳组织成纤维细胞的研究
• 2.2.2 细胞生物学特性的研究
• 2.2.3 牛体外受精的研究
• 2.2.4 牛体细胞核移植的研究
• 2.2.5 胚胎的体外培养
• 2.3 数据统计分析
• 3 结果与分析
• 3.1 种公牛耳组织成纤维细胞系的建立
• 3.1.1 原代细胞的生长状态及形态特征
• 3.1.2 传代细胞的生长状态及形态特征
• 3.1.3 细胞的冻存与复苏
• 3.2 牛成纤维细胞生物学特性的研究
• 3.2.1 细胞活力测定
• 3.2.2 细胞生长曲线绘制
• 3.2.3 细胞微生物（细菌、支原体）污染检测
• 3.2.4 细胞染色体的分裂相
• 3.3 牛体外受精胚胎发育的研究
• 3.4 牛体细胞核移植胚胎发育的研究
• 4 讨论
• 4.1 种公牛耳组织成纤维细胞的培养
• 4.1.1 实验取材
• 4.1.2 细胞培养
• 4.1.3 细胞冻存与复苏
• 4.1.4 生长曲线
• 4.1.5 微生物污染
• 4.2 牛体外受精胚胎的发育
• 4.3 牛体细胞核移植胚胎的发育
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文