论文摘要
目的:1.从三龄家蝇幼虫体内分离纯化,筛选具有抗肿瘤细胞K562（人慢性髓性白血病细胞）的抗菌肽,并鉴定其是否对人正常细胞293T有抑制作用。2.观察分离纯化得到的抗菌肽对K562细胞存活率及生长曲线的影响,以及其对细胞膜通透性的影响,判断其活性发挥的最佳质量浓度和作用时间,同时判断抗菌肽对K562细胞膜的损伤程度,以及作用机制是否有直接杀伤作用;3.观察分离纯化得到的抗菌肽对K562细胞细胞核和线粒体膜电位以及凋亡蛋白半胱天冬氨酸蛋白酶（caspase-3）的影响,从而探讨抗菌肽杀伤K562的作用机制是否有诱导凋亡。方法:1.通过针刺感染大肠杆菌诱导家蝇三龄幼虫大量表达抗菌肽,然后经过研磨、离心、固相萃取（solidphaseextraction,SPE）、反相高效液相色谱（reversed-phasehigh-performanceliquidchromatography,RP-HPLC）分离纯化家蝇三龄幼虫抗菌肽,采用四甲基偶氮噻唑蓝（methylthiazolyltetrazolium,MTT）比色法和光学显微镜观察,筛选出对K562有杀伤作用的抗菌肽。通过对比反相高效液相色谱仪在紫外波长214nm和280nm时的色谱图鉴定纯化组分的蛋白质性。同时用MTT法检测筛选出的抗菌肽组分峰58对人正常细胞293T的作用。2.采用台盼蓝拒染计数法,记录不同作用浓度和不同作用时间时K562细胞的存活率及其相对抑制率,从而绘制生长曲线,观察发挥活性的最佳质量作用浓度和作用时间;同时用光学显微镜观察细胞形态的变化;3.小分子荧光素二乙酸荧光素FDA（FluoresceinDiacetate）标记,用荧光分光光度计检测细胞膜荧光素的渗漏;用大分子荧光探针Dextran-FITC（40KD）标记,激光扫描共聚焦显微镜（laserscanningconfocalmicroscope,LSCM）观察对K562细胞膜对大分子的通透性;4.用Hoechst33258荧光标记,用荧光显微镜检测家蝇三龄幼虫峰5、峰8组分作用于K562细胞后,K562细胞核相对荧光强度的变化;以采用荧光探针罗丹明123负载,用激光共聚焦显微镜观察家蝇幼虫抗菌肽对K562细胞线粒体膜电位的影响,以细胞内荧光强度表示线粒体膜电位大小。用caspase-3检测试剂盒和酶标仪测定caspase-3酶的活性。结果:1.固相萃取得到10%、30%、80%的的乙腈水溶液组分与对照组比较,经方差分析具有统计学意义（P<0.05）,其中用Dunnett-t法对各组分分别与对照组进行比较,三个组分与对照组差异均有统计学意义（P<0.05）,其中sp8组分对K562细胞相对抑制率（inhibitionratio,IR）最高为84.98%。其中sp8组分经反相高效液相色谱纯化,通过观察波长为214nm和280nm条件下的色谱图,并根据保留时间和分离度推断出:波长214nm时出现的峰58分别与波长280nm时出现的峰cf相对应,同时,因为280nm是含芳香族氨基酸蛋白质的特质吸收峰,所以认为峰58组分就是抗菌肽。根据分离度判定标准,4个峰组分的分离度都在1.5以上,满足定量分析的要求,所以选择这4个峰进行后续实验。经Dunnett-t法检验,峰5～8分别与对照组比较,差异均有统计学意义（P<0.05）（表1-3）,说明这4个峰（峰58）对K562细胞都有抑制作用。当质量浓度为100μg/ml作用24h,峰5和峰8相对抑制率较高,分别为48.52%和65.80%。sp8和峰58组分分别与对照组比较,经t检验,差异无统计学意义（P>0.05）,说明抗菌肽sp8组分和峰58组分都对人正常细胞293T无抑制作用。2.台盼兰拒染计数法检测存活率和生长曲线发现:检测到的不同质量浓度的sp8和峰58处理K562细胞24h后,各组分对K562细胞都有抑制作用,但是不成线性关系,25μg/ml基本没有作用,50μg/ml时对K562细胞的作用较低,100μg/ml在细胞的抑制基本由不到半数到超过半数,以sp8、峰5、峰8组最为明显。低质量浓度组（<25μg/ml）与对照组（0μg/ml）比较,差异无统计学意义（P>0.05）;高质量浓度组分别与低质量浓度组两两比较,差异均有统计学意义（P<0.05）。当质量浓度为50μg/ml和100μg/ml时,峰5、峰8分别和峰6、峰7组两两比较,差异均有统计学意义（P<0.05）。sp8和峰5、峰8作用组质量浓度为100μg/ml对K562细胞作用24小时后,在100倍光镜下,对照组细胞形态完整;,对照组K562细胞视野凌乱,呈现出破碎程度不等的状态,细胞发生变形,有的细胞形成缺口,内容物正在通过缺口向外释放,即将发生细胞分解。sp8、峰58各组分当浓度为50μg/ml和100μg/ml时,随着作用时间的增加,K562细胞的抑制率基本上呈逐渐升高,到24h左右达到一个高峰后开始逐渐降低,当在48h时进行换液加药后,抑制率再次呈逐渐升高继而下降的趋势;当浓度为200μg/ml时,随着作用时间的增加,K562细胞的抑制率表现为持续上升,当48h时进行换液处理后,抑制率明显升高继而持续上升。另外,对K562细胞的抑制率在48h时处理前后均不成线性关系。3.不同浓度峰5和峰8处理K562细胞后,作用浓度低于50μg/ml的低浓度组相对荧光强度为（18.95±0.05）22.49±0.68,作用浓度50μg/ml以上的高浓度组相对荧光强度为（62.77±4.08）70.81±0.18。经单因素方差分析,高浓度各组（>50μg/ml）相对荧光强度分别与低浓度各组（<50μg/ml）进行两两比较LSD法,差异有统计学意义（P<0.05）。峰5、峰8作用2h后,K562细胞膜对小分子荧光素FDA均有外泄。激光扫描共聚焦显微镜下观察到,细胞经100μg/mL的l峰5、峰8组分处理2h,40KD的大分子荧光探针Dextran-FITC,个别分布在细胞膜上,而经24小时处理后,荧光探针进入细胞,在细胞内形成亮点或亮块,强度不一。这说明表明处理达到一定时间,细胞膜能通过40KD的大分子。4.Hoechst33258染色显示:对照组的细胞核接近圆形,染色均匀而明亮,而当质量浓度为100μg/ml的峰5和（或）峰8组分作用24h后,有些细胞核破碎成块状,部分染色呈弥散趋势,说明家蝇三龄幼虫抗菌肽可以引起K562细胞核损伤;部分细胞核的荧光强度增强,说明可以引起K562细胞发生凋亡;用罗丹明123标记,激光共聚焦显微镜观察发现,对照组与抗菌肽峰5、峰8组的荧光强度经t检验具有统计学意义（P<0.05）,对照组细胞内罗丹明123荧光强度很强,而抗菌肽组峰5、峰8作用组细胞内罗丹明123荧光强度很弱,说明家蝇三龄幼虫抗菌肽可以使K562细胞线粒体膜电位降低;抗菌肽峰5、峰8组分作用组caspase-3的含量明显高于对照组,两组caspase-3含量经t检验具有统计学意义（P<0.05）,说明家蝇三龄幼虫抗菌肽作用K562细胞后可以激活caspase-3,促进凋亡。结论:1.家蝇三龄幼虫体内存在抑制K562细胞生长的抗菌肽和抗菌物质。本实验得到峰5～8抗菌肽,其中峰5和峰8对K562细胞的抑制活性最强,对人正常细胞293T几乎没有作用,这与多数文献的报道一致。2.家蝇三龄幼虫抗菌肽对K562细胞膜的作用存在质量浓度阈值,低质量浓度时可引起膜通透性增加,高质量浓度时可引起细胞膜严重损伤。家蝇幼虫抗菌肽可能通过直接杀伤作用抑制K562细胞生长,其作用机制首先是通过对膜作用,然后可能进一步对膜作用从而使膜上孔洞不断扩大或者进入细胞后经过其它途径抑制K562细胞生长。3.家蝇三龄幼虫抗菌肽峰5、峰8对K562细胞核具有损伤作用,可以引起K562细胞发生凋亡,作用机制是通过降低K562细胞线粒体膜电位,激活caspase-3,扰乱其生理功能,促使其凋亡。
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