论文摘要
本论文的主要研究内容包括:(Ⅰ)通过基因枪遗传转化法轰击小麦未成熟胚,获得携带有水稻几丁质酶基因RC24的转基因小麦,对T0和T1代转基因小麦植株的条锈病抗性进行了研究。(Ⅱ)根据己知抗病基因的保守序列设计引物,分离克隆小麦NBS-LRR类基因同源序列,获得三条与已知抗病基因同源的序列,并通过Northern印迹杂交技术分析了这三条序列的时空表达情况。(Ⅲ)建立了苦荞的植株再生体系及发根农杆菌遗传转化体系,对获得的再生植株和毛状根中次生代谢产物芦丁的含量进行了测定。 Ⅰ.以预培养3-4d的冬小麦品种西农88、宝丰7228、黑小麦、盐2、80101T、甘麦、西农1376和西农8727开花受粉8~15d后的未成熟胚(大小为0.8~1.5mm)为材料,利用基因枪(型号:PDS1000/氦气)将水稻几丁质酶基因导入小麦未成熟胚盾片组织。转化过程中一共采用了三种质粒组合,质粒pYA024(含有水稻几丁质酶基因RC24和选择标记基因npt Ⅱ)轰击的小麦未成熟胚转至附加150mg/L硫酸卡那霉素的培养基上进行筛选和分化;质粒组合pARN6+pDB1(前者含水稻几丁质酶基因RC24,后者含β-葡糖苷酸酶基因gus和选择标记基因bar)和pBAB3(含水稻几丁质酶基因RC24)+pDB1轰击的小麦未成熟胚转至附加2mg/L除草剂PPT的培养基上进行筛选和分化。小麦未成熟胚在经过轰击、筛选和分化后,获得5株再生绿苗。PCR和Southern印迹分析结果显示,5株再生植株中4株为阳性,其中质粒pYA024轰击后获得1株,质粒组合pARN6+pDB1轰击后获得1株,质粒组合pBAB3+pOB1轰击后获得2株,平均转化频率为0.30%。不同基因型小麦的转化频率表现出非常显著的差异:西农88的转化效果最好,转化频率可达1.38%;其次是宝丰7288,转化频率为0.59%;甘麦的转化频率为0.49%从西农1376、黑小麦、盐2、80101T和西农8727没有获得转基因植株。对转基因小麦进行形态学观察发现,与对照相比T0代转化植株的分蘖数、株籽粒数、千粒重、株高、穗长、节间数等均无叫显变化。田间抗条锈菌实验结果表明,西农88T0和T1代转基因小麦的抗病性最好,为近免疫性,宝丰7228和甘麦
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摘要Abstract第一部分 应用基因枪法将水稻几丁质酶基因导入小麦的研究Ⅰ 文献综述1 小麦的遗传转化研究进展2 再生体系的建立3 小麦遗传转化主要方法3.1 基因枪转化法3.2 农杆菌介导法3.3 原生质体转化法3.4 其他方法4 小麦遗传转化的报告基因和选择标记基因4.1 报告基因4.2 选择标记基因5 转基因小麦的分子检测6 外源基因在转基因小麦中的整合与表达6.1 外源基因在转基因小麦中的整合6.2 外源基因在转基因小麦中的表达7 小麦遗传转化中存在的主要问题和展望8 本研究的目的和意义Ⅱ 材料与方法1 材料1.1 植物材料1.2 质粒的构建、提取、检测和酶切分析1.2.1 质粒的构建1.2.2 质粒 DNA的提取1.2.3 DNA的电泳检测1.2.4 紫外分光光度法测定质粒 DNA含量1.2.5 质粒 DNA的酶切分析1.3 微弹的制备1.4 渗透处理和微弹轰击1.5 培养、选择和再生体系1.6 gus基因瞬间表达1.7 再生植株的分子鉴定1.7.1 小麦基因组DNA的提取1.7.2 再生植株的 PCR检测1.7.3 再生植株的Southern杂交检验1.8 转基因小麦植株及其T1代的形态学观察1.9 转基因小麦后代植株的田间抗条锈病试验Ⅲ 结果与分析1 抗性愈伤组织筛选和植株再生1.1 基因型对胚性愈伤组织再生植株分蘖、越冬的影响1.2 幼胚的选择对小麦幼胚胚性愈伤组织诱导及分化的影响1.3 经不同预培养时间的幼胚对转化频率的影响2 各因素对β-葡糖苷酸酶(GUS)基因瞬时表达的影响2.1 蔗糖处理时间对GUS瞬时表达效果的影响2.2 金粒对轰击效果的影响2.3 不同微弹用量和轰击次数对GUS表达的影响2.4 基因枪轰击参数对GUS瞬时表达效果的影响3 质粒选择以及筛选剂浓度的分析4 质粒DNA的酶切分析5 转基因小麦植株的PCR检测6 转基因小麦植株T0代的southern印记分析7 转基因小麦植株T1代的Southern杂交分析8 不同基因型转化效果的差异9 转基因小麦植株的形态学观察10 转基因小麦植株田间抗条锈病实验11 转基因小麦T1代植株田间抗条锈病实验Ⅳ 讨论参考文献第二部分 小麦防御系统中抗病基因同源物的克隆和鉴定Ⅰ 文献综述1 植物抗病性的遗传模式1.1 与不亲和因子相关的互作模式1.2 与亲和因子相关的互作模式1.3 激发子/受体假说2 R基因的克隆2.1 转座子标签技术(transposon tagging)2.2 图位克隆(positional cloning or map-based cloning)2.3 基于同源序列的候选基因法(homology-based candidate gene method cloning)2.4 其它方法3 R蛋白的结构特征3.1 富亮氨酸重复序列(leucine-rich repeat, LRR)3.2 核苷酸结合位点(nucleotide-binding site,NBS)3.3 丝氨酸/苏氨酸激酶结构域(Ser/Thr Kinase,STK)3.4 亮氨酸拉链(leucine-zipper,LZ)3.5 R基因其它未知功能的保守区4 R基因的类型4.1 细胞内的蛋白激酶(Ser/thr)4.2 具有胞外LRR结构的类似受体的蛋白激酶4.3 胞内的NBS-LRR类4.4 跨膜的LRR类4.5 毒素还原酶类基因5 信号传导5.1 R基因介导的抗病信号传导的特异性5.2 细胞程序化死亡与植物的抗病性5.3 水杨酸(salicylic acid,SA)介导的抗病信号途径5.4 茉莉酮酸(jasmonic acid,JA)和乙烯介导的抗病信号转导途径5.5 抗病信号途径的复杂性6 本研究的内容、目的和意义Ⅱ 材料与方法1 实验材料2 方法2.1 基因组DNA的提取2.2 植物总RNA的提取2.3 PCR扩增2.4 PCR产物的回收2.5 回收产物的连接2.6 大肠杆菌感受态细胞的制备2.7 连接产物的大肠杆菌转化2.8 重组质粒的提取2.9 重组质粒的酶切鉴定2.10 DNA序列测定2.11 Norhtern杂交检测2.11.1 杂交探针的制备2.11.2 Northern杂交检测Ⅲ 结果与分析1 小麦R基因NBS-LRR类同源片段的获得2 小麦NBS-LRR同源片段的序列分析3 小麦R基因NBS-LRR同源序列的表达检测Ⅳ 讨论参考文献第三部分 发根农杆菌介导的苦荞麦遗传转化Ⅰ 文献综述1 发根农杆菌Ri质粒的分子生物学特性2 发根农杆菌转化植物细胞的机制3 Ri载体的构建4 Ri质粒的转化方法5 Ri质粒的转化步骤6 毛状根的鉴定6.1 形态学观察6.2 冠瘿碱的检测6.3 DNA分子杂交7 毛状根的特性与优点7.1 激素自主性7.2 稳定性7.3 高产性8 Ri质粒的应用9 Ri质粒转化药用植物的研究10 展望11 研究内容、目的和意义Ⅱ 材料与方法1 实验材料1.1 植物材料1.2 发根农杆菌菌株2 实验方法2.1 苦荞离体再生体系的建立2.1.1 外植体的获得2.1.2 愈伤组织的诱导和继代培养2.1.3 苗的分化2.1.4 炼苗和移栽2.1.5 再生苗各部分及愈伤组织芦丁含量的测定2.2 发根农杆菌介导的遗传转化2.2.1 无菌外植体的获得2.2.2 发根农杆菌菌液的制备2.2.3 转化2.2.4 毛状根离体培养系的建立2.2.5 不同培养基对毛状根生长的影响2.2.6 不同培养方法对毛状根生长的影响2.2.7 不同蔗糖浓度对毛状根生长的影响2.2.8 毛状根的鉴定2.2.9 HPLC测定毛状根的芦丁含量Ⅲ 结果与分析1 不同培养基及激素组合对愈伤组织诱导的影响2 不同抗氧化剂对愈伤组织褐变的影响3 苗的分化及不同激素组合对苗形成的影响4 根的分化和植株的移栽5 再生苗各部分及愈伤组织的芦丁含量测定的结果5.1 标样的回归方程的建立和相关系数的计算5.2 大田生长的苦荞各组织中芦丁含量的测定5.3 再生苗根、茎、叶、花和愈伤组织芦丁含量的测定6 不同外植体对农杆菌转化的影响7 不同转染时间对外植体生长的影响8 不同培养基对毛状根生长的影响9 不同培养方法对毛状根生长的影响10 不同蔗糖浓度对毛状根生长的影响11 毛状根的PCR检测12 毛状根冠瘿碱的检测13 毛状根中芦丁含量的测定结果Ⅳ 讨论1 苦荞麦的组织培养2 发根农杆菌对苦荞的遗传转化3 苦荞愈伤组织、再生植株及毛状根芦丁含量的分析参考文献本研究的创新点研究有待进一步解决的问题致谢攻读博士学位期间发表论文附件
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标签:小麦论文; 遗传转化论文; 基因枪论文; 抗病基因论文; 苦荞论文; 发根农杆菌论文;
小麦NBS-LRR抗性基因克隆以及基因枪介导的遗传转化和由发根农杆菌介导的苦荞遗传转化
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