小麦NBS-LRR抗性基因克隆以及基因枪介导的遗传转化和由发根农杆菌介导的苦荞遗传转化

小麦NBS-LRR抗性基因克隆以及基因枪介导的遗传转化和由发根农杆菌介导的苦荞遗传转化

论文摘要

本论文的主要研究内容包括:(Ⅰ)通过基因枪遗传转化法轰击小麦未成熟胚,获得携带有水稻几丁质酶基因RC24的转基因小麦,对T0和T1代转基因小麦植株的条锈病抗性进行了研究。(Ⅱ)根据己知抗病基因的保守序列设计引物,分离克隆小麦NBS-LRR类基因同源序列,获得三条与已知抗病基因同源的序列,并通过Northern印迹杂交技术分析了这三条序列的时空表达情况。(Ⅲ)建立了苦荞的植株再生体系及发根农杆菌遗传转化体系,对获得的再生植株和毛状根中次生代谢产物芦丁的含量进行了测定。 Ⅰ.以预培养3-4d的冬小麦品种西农88、宝丰7228、黑小麦、盐2、80101T、甘麦、西农1376和西农8727开花受粉8~15d后的未成熟胚(大小为0.8~1.5mm)为材料,利用基因枪(型号:PDS1000/氦气)将水稻几丁质酶基因导入小麦未成熟胚盾片组织。转化过程中一共采用了三种质粒组合,质粒pYA024(含有水稻几丁质酶基因RC24和选择标记基因npt Ⅱ)轰击的小麦未成熟胚转至附加150mg/L硫酸卡那霉素的培养基上进行筛选和分化;质粒组合pARN6+pDB1(前者含水稻几丁质酶基因RC24,后者含β-葡糖苷酸酶基因gus和选择标记基因bar)和pBAB3(含水稻几丁质酶基因RC24)+pDB1轰击的小麦未成熟胚转至附加2mg/L除草剂PPT的培养基上进行筛选和分化。小麦未成熟胚在经过轰击、筛选和分化后,获得5株再生绿苗。PCR和Southern印迹分析结果显示,5株再生植株中4株为阳性,其中质粒pYA024轰击后获得1株,质粒组合pARN6+pDB1轰击后获得1株,质粒组合pBAB3+pOB1轰击后获得2株,平均转化频率为0.30%。不同基因型小麦的转化频率表现出非常显著的差异:西农88的转化效果最好,转化频率可达1.38%;其次是宝丰7288,转化频率为0.59%;甘麦的转化频率为0.49%从西农1376、黑小麦、盐2、80101T和西农8727没有获得转基因植株。对转基因小麦进行形态学观察发现,与对照相比T0代转化植株的分蘖数、株籽粒数、千粒重、株高、穗长、节间数等均无叫显变化。田间抗条锈菌实验结果表明,西农88T0和T1代转基因小麦的抗病性最好,为近免疫性,宝丰7228和甘麦

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 第一部分 应用基因枪法将水稻几丁质酶基因导入小麦的研究
  • Ⅰ 文献综述
  • 1 小麦的遗传转化研究进展
  • 2 再生体系的建立
  • 3 小麦遗传转化主要方法
  • 3.1 基因枪转化法
  • 3.2 农杆菌介导法
  • 3.3 原生质体转化法
  • 3.4 其他方法
  • 4 小麦遗传转化的报告基因和选择标记基因
  • 4.1 报告基因
  • 4.2 选择标记基因
  • 5 转基因小麦的分子检测
  • 6 外源基因在转基因小麦中的整合与表达
  • 6.1 外源基因在转基因小麦中的整合
  • 6.2 外源基因在转基因小麦中的表达
  • 7 小麦遗传转化中存在的主要问题和展望
  • 8 本研究的目的和意义
  • Ⅱ 材料与方法
  • 1 材料
  • 1.1 植物材料
  • 1.2 质粒的构建、提取、检测和酶切分析
  • 1.2.1 质粒的构建
  • 1.2.2 质粒 DNA的提取
  • 1.2.3 DNA的电泳检测
  • 1.2.4 紫外分光光度法测定质粒 DNA含量
  • 1.2.5 质粒 DNA的酶切分析
  • 1.3 微弹的制备
  • 1.4 渗透处理和微弹轰击
  • 1.5 培养、选择和再生体系
  • 1.6 gus基因瞬间表达
  • 1.7 再生植株的分子鉴定
  • 1.7.1 小麦基因组DNA的提取
  • 1.7.2 再生植株的 PCR检测
  • 1.7.3 再生植株的Southern杂交检验
  • 1.8 转基因小麦植株及其T1代的形态学观察
  • 1.9 转基因小麦后代植株的田间抗条锈病试验
  • Ⅲ 结果与分析
  • 1 抗性愈伤组织筛选和植株再生
  • 1.1 基因型对胚性愈伤组织再生植株分蘖、越冬的影响
  • 1.2 幼胚的选择对小麦幼胚胚性愈伤组织诱导及分化的影响
  • 1.3 经不同预培养时间的幼胚对转化频率的影响
  • 2 各因素对β-葡糖苷酸酶(GUS)基因瞬时表达的影响
  • 2.1 蔗糖处理时间对GUS瞬时表达效果的影响
  • 2.2 金粒对轰击效果的影响
  • 2.3 不同微弹用量和轰击次数对GUS表达的影响
  • 2.4 基因枪轰击参数对GUS瞬时表达效果的影响
  • 3 质粒选择以及筛选剂浓度的分析
  • 4 质粒DNA的酶切分析
  • 5 转基因小麦植株的PCR检测
  • 6 转基因小麦植株T0代的southern印记分析
  • 7 转基因小麦植株T1代的Southern杂交分析
  • 8 不同基因型转化效果的差异
  • 9 转基因小麦植株的形态学观察
  • 10 转基因小麦植株田间抗条锈病实验
  • 11 转基因小麦T1代植株田间抗条锈病实验
  • Ⅳ 讨论
  • 参考文献
  • 第二部分 小麦防御系统中抗病基因同源物的克隆和鉴定
  • Ⅰ 文献综述
  • 1 植物抗病性的遗传模式
  • 1.1 与不亲和因子相关的互作模式
  • 1.2 与亲和因子相关的互作模式
  • 1.3 激发子/受体假说
  • 2 R基因的克隆
  • 2.1 转座子标签技术(transposon tagging)
  • 2.2 图位克隆(positional cloning or map-based cloning)
  • 2.3 基于同源序列的候选基因法(homology-based candidate gene method cloning)
  • 2.4 其它方法
  • 3 R蛋白的结构特征
  • 3.1 富亮氨酸重复序列(leucine-rich repeat, LRR)
  • 3.2 核苷酸结合位点(nucleotide-binding site,NBS)
  • 3.3 丝氨酸/苏氨酸激酶结构域(Ser/Thr Kinase,STK)
  • 3.4 亮氨酸拉链(leucine-zipper,LZ)
  • 3.5 R基因其它未知功能的保守区
  • 4 R基因的类型
  • 4.1 细胞内的蛋白激酶(Ser/thr)
  • 4.2 具有胞外LRR结构的类似受体的蛋白激酶
  • 4.3 胞内的NBS-LRR类
  • 4.4 跨膜的LRR类
  • 4.5 毒素还原酶类基因
  • 5 信号传导
  • 5.1 R基因介导的抗病信号传导的特异性
  • 5.2 细胞程序化死亡与植物的抗病性
  • 5.3 水杨酸(salicylic acid,SA)介导的抗病信号途径
  • 5.4 茉莉酮酸(jasmonic acid,JA)和乙烯介导的抗病信号转导途径
  • 5.5 抗病信号途径的复杂性
  • 6 本研究的内容、目的和意义
  • Ⅱ 材料与方法
  • 1 实验材料
  • 2 方法
  • 2.1 基因组DNA的提取
  • 2.2 植物总RNA的提取
  • 2.3 PCR扩增
  • 2.4 PCR产物的回收
  • 2.5 回收产物的连接
  • 2.6 大肠杆菌感受态细胞的制备
  • 2.7 连接产物的大肠杆菌转化
  • 2.8 重组质粒的提取
  • 2.9 重组质粒的酶切鉴定
  • 2.10 DNA序列测定
  • 2.11 Norhtern杂交检测
  • 2.11.1 杂交探针的制备
  • 2.11.2 Northern杂交检测
  • Ⅲ 结果与分析
  • 1 小麦R基因NBS-LRR类同源片段的获得
  • 2 小麦NBS-LRR同源片段的序列分析
  • 3 小麦R基因NBS-LRR同源序列的表达检测
  • Ⅳ 讨论
  • 参考文献
  • 第三部分 发根农杆菌介导的苦荞麦遗传转化
  • Ⅰ 文献综述
  • 1 发根农杆菌Ri质粒的分子生物学特性
  • 2 发根农杆菌转化植物细胞的机制
  • 3 Ri载体的构建
  • 4 Ri质粒的转化方法
  • 5 Ri质粒的转化步骤
  • 6 毛状根的鉴定
  • 6.1 形态学观察
  • 6.2 冠瘿碱的检测
  • 6.3 DNA分子杂交
  • 7 毛状根的特性与优点
  • 7.1 激素自主性
  • 7.2 稳定性
  • 7.3 高产性
  • 8 Ri质粒的应用
  • 9 Ri质粒转化药用植物的研究
  • 10 展望
  • 11 研究内容、目的和意义
  • Ⅱ 材料与方法
  • 1 实验材料
  • 1.1 植物材料
  • 1.2 发根农杆菌菌株
  • 2 实验方法
  • 2.1 苦荞离体再生体系的建立
  • 2.1.1 外植体的获得
  • 2.1.2 愈伤组织的诱导和继代培养
  • 2.1.3 苗的分化
  • 2.1.4 炼苗和移栽
  • 2.1.5 再生苗各部分及愈伤组织芦丁含量的测定
  • 2.2 发根农杆菌介导的遗传转化
  • 2.2.1 无菌外植体的获得
  • 2.2.2 发根农杆菌菌液的制备
  • 2.2.3 转化
  • 2.2.4 毛状根离体培养系的建立
  • 2.2.5 不同培养基对毛状根生长的影响
  • 2.2.6 不同培养方法对毛状根生长的影响
  • 2.2.7 不同蔗糖浓度对毛状根生长的影响
  • 2.2.8 毛状根的鉴定
  • 2.2.9 HPLC测定毛状根的芦丁含量
  • Ⅲ 结果与分析
  • 1 不同培养基及激素组合对愈伤组织诱导的影响
  • 2 不同抗氧化剂对愈伤组织褐变的影响
  • 3 苗的分化及不同激素组合对苗形成的影响
  • 4 根的分化和植株的移栽
  • 5 再生苗各部分及愈伤组织的芦丁含量测定的结果
  • 5.1 标样的回归方程的建立和相关系数的计算
  • 5.2 大田生长的苦荞各组织中芦丁含量的测定
  • 5.3 再生苗根、茎、叶、花和愈伤组织芦丁含量的测定
  • 6 不同外植体对农杆菌转化的影响
  • 7 不同转染时间对外植体生长的影响
  • 8 不同培养基对毛状根生长的影响
  • 9 不同培养方法对毛状根生长的影响
  • 10 不同蔗糖浓度对毛状根生长的影响
  • 11 毛状根的PCR检测
  • 12 毛状根冠瘿碱的检测
  • 13 毛状根中芦丁含量的测定结果
  • Ⅳ 讨论
  • 1 苦荞麦的组织培养
  • 2 发根农杆菌对苦荞的遗传转化
  • 3 苦荞愈伤组织、再生植株及毛状根芦丁含量的分析
  • 参考文献
  • 本研究的创新点
  • 研究有待进一步解决的问题
  • 致谢
  • 攻读博士学位期间发表论文
  • 附件
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