蒺藜苜蓿防御素基因MsDef1遗传转化甘蔗的研究

论文摘要

甘蔗（Saccharum officinarum L.）是一种及其重要的糖料和经济作物,但日益严重的病害却制约了甘蔗产业的发展,甘蔗黑穗病是对甘蔗危害最为严重的一种病害。传统防治方法对黑穗病的防治效果甚微,利用植物基因工程技术把抗病基因导入甘蔗优良品种,使其得到有效表达从而表现出抗病性,是防治甘蔗真菌病害最为有效的途径之一。蒺藜苜蓿防御素MsDef1是从蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）中分离得到的一种植物防御素,具有很好的抗真菌活性。因此,将MsDef1基因导入甘蔗优良品种中使其得到有效表达,可有望提高甘蔗对黑穗病的抗性。主要实验结果如下：1.分别构建了以Bar基因作为筛选标记的native MsDef1基因和synthetic MsDef1基因的植物表达载体pMsDN和pMsDS。2.采用农杆菌介导法对甘蔗胚性愈伤组织进行转化,经PPT抗性筛选和PCR检测,获得了转native MsDef1基因植株34株,转synthetic MsDef1基因植株33株,初步证明外源基因已整合到甘蔗基因组中。3.选取转native MsDef1基因植株4株进行目的基因的RT-PCR检测,3株呈阳性；选取转synthetic MsDef1基因植株6株进行目的基因的RT-PCR检测,4株呈阳性,初步证明native MsDef1基因和synthetic MsDef1基因在转录水平上得到了表达。4.选取转synthetic MsDef1基因的5株PCR阳性植株进行Southern Blot检测,其中植株3,4有杂交信号,证明外源基因已整合到甘蔗的基因组中。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 序言
• 1.1 甘蔗的概况
• 1.1.1 甘蔗简介
• 1.1.2 甘蔗是我国重要的糖料作物
• 1.1.3 甘蔗是重要的能源作物
• 1.1.4 甘蔗副产品利用
• 1.1.5 甘蔗遗传转化的研究进展
• 1.2 甘蔗的主要病害
• 1.2.1 甘蔗的黑穗病病害
• 1.2.2 甘蔗的赤腐病病害
• 1.2.3 甘蔗的梢腐病病害
• 1.2.4 甘蔗的凤梨病病害
• 1.2.5 甘蔗的褐条病病害
• 1.2.6 甘蔗的黄斑病病害
• 1.3 防御素的研究进展
• 1.3.1 防御素的结构和类型
• 1.3.2 防御素的基本作用机制
• 1.3.3 防御素的生物活性
• 1.3.4 植物防御素的研究进展
• 1.3.5 蒺藜苜蓿植物防御素的研究进展
• 1.4 本论文的研究目的,研究内容和技术路线
• 1.4.1 研究目的
• 1.4.2 研究内容
• 1.4.3 技术路线
• 2 材料与方法
• 2.1 材料与试剂
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 质粒及菌种
• 2.1.3 酶与生化试剂
• 2.2 培养基及常用抗生素、激素的配制
• 2.2.1 培养基的配制
• 2.2.2 抗生素及激素的配制
• 2.3 实验仪器
• 2.4 native MsDef1植物表达载体的pMsDN的构建
• 2.4.1 质粒pPZP-212和pCAMBIA3300的大量提取及纯化
• 2.4.2 质粒pPZP-212和pCAMBIA3300的酶切、连接和转化
• 2.4.3 重组质粒DNA的小量提取
• 2.4.4 重组质粒pMsDN的电泳分析
• 2.4.5 重组质粒pMsDN的酶切鉴定
• 2.4.6 重组菌pMsDN的保存
• 2.4.7 植物表达载体pMsDN转化农杆菌
• 2.5 synthetic MsDef1植物表达载体的pMsDS的构建
• 2.5.1 质粒pPZP-202和pCAMBIA3300的大量提取及纯化
• 2.5.2 质粒pPZP-202和pCAMBIA3300的酶切、连接和转化
• 2.5.3 重组质粒DNA的小量提取
• 2.5.4 重组质粒pMsDS的电泳分析
• 2.5.5 重组质粒pMsDS的酶切鉴定
• 2.5.6 重组菌pMsDS的保存
• 2.5.7 植物表达载体pMsDS转化农杆菌
• 2.6 native MsDef1基因和synthetic MsDef1基因遗传转化甘蔗
• 2.6.1 甘蔗转化材料及其农杆菌菌液的准备
• 2.6.2 农杆菌侵染愈伤组织及共培养
• 2.6.3 农杆菌侵染后的愈伤组织分化成苗
• 2.6.4 甘蔗小植株的筛选培养
• 2.6.5 甘蔗抗性苗的炼苗
• 2.7 转化植株的分子检测
• 2.7.1 甘蔗总DNA的微量提取
• 2.7.2 转化植株的PCR检测
• 2.7.3 转化植株的RT-PCR检测
• 2.7.4 转化植株的Southern blot检测
• 3 结果与分析
• 3.1 native MsDef1植物表达载体pMsDN的构建
• 3.2 synthetic MsDef1植物表达载体pMsDS的构建
• 3.3 植物表达载体导入农杆菌
• 3.3.1 植物表达载体pMsDN导入农杆菌
• 3.3.2 植物表达载体pMsDS导入农杆菌
• 3.4 农杆菌接到的甘蔗转化
• 3.4.1 甘蔗胚性愈伤组织的诱导及分化成苗
• 3.4.2 农杆菌侵染后的愈伤组织分化成苗及其PPT的筛选
• 3.4.3 甘蔗抗性苗的炼苗
• 3.5 转基因植株的分子检测
• 3.5.1 甘蔗总DNA的微量提取
• 3.5.2 转化植株的PCR检测
• 3.5.3 部分转化植株的RT-PCR检测
• 3.5.4 Southern Blot检测
• 4. 结论
• 5 讨论
• 5.1 关于农杆菌菌株EHA105
• 5.2 关于甘蔗抗性苗的PPT筛选
• 5.3 关于蒺藜苜蓿防御素基因MsDef1
• 5.4 本实验的后续工作
• 6. 参考文献
• 7 英文缩写符号及中英文对照表
• 致谢