杨丹1曾建涛2郑兆斌3
（1.重庆市长寿区中医院肾病科重庆长寿401220）
（2.重庆市长寿区人民医院检验科重庆长寿401220）
（3.重庆市长寿区人民医院心内科重庆长寿401220）
【摘要】目的：从分子网络水平筛选糖尿病肾病诊断的标志物。方法：在GEO数据库下载糖尿病肾病的基因表达数据，应用Array-Tools软件分析差异表达基因，STRING工具用于构建差异蛋白的相互作用网络。结合组织特异表达数据库TiGER，筛选肾脏组织相关的HUB蛋白作为糖尿病肾病生物标志物。结果：肾小球组织有906个差异表达基因，其中上调基因689个，下调基因217个；肾小管组织有828个差异表达基因，其中上调基因266个，下调基因562个。通过网络构建及组织特异性筛选，在肾脏组织差异表达的HUB蛋白为GZMA、SPP1,TGFBI,FGL2,KNG1,VCAM1和EGF。结论：通过生物信息学研究，筛选出7种蛋白质可能成为糖尿病肾病诊断的标志物。
【关键词】糖尿病肾病；生物信息学；生物标志物
【中图分类号】R587.2【文献标识码】A【文章编号】1003-5028（2015）8-0679-02
Screeningthebiomarkersofdiabetic
nephropathybybioinformaticsmethods
YangDan1，ZengJiantao2，ZhengZhaobin3
（1.DepartmentofNephrology,ThetraditionalChinesemedicalhospitalofChangshou,Chongqing,401220）
（2.DepartmentofClinicalLaboratory,ThePeople’sHospitalofChangshou,Chongqing,401220）
（3.Departmentofcardiology,ThePeople’sHospitalofChangshou,Chongqing,401220）
【Abstract】Objective:ToscreenbiomarkersofdiabeticnephropathyinBiomolecularNetworklevel.Methods:GeneexpressiondataofkidneyweregotfromGeneExpressionOmnibusdatabase.Array-Toolssoftwarewasusedtoanalyzedifferentialexpressiongene.ThenTheprotein-proteininteraction(PPI)networksofdifferentialexpressiongenewereconstructedbySTRING.ConsideringthedatabaseofTiGER,theHUBproteinswhichexpressspecificityinkidneywerefiltedasbiomarkersofdiabeticnephropathy.Results:906differentiallyexpressedgeneswereindentifiedinglomcrulus,including689up-regulatedand217down-regulatedgenes.828differentiallyexpressedgeneswereindentifiedinrenaltubule,including266up-regulatedand562down-regulatedgenes.SeveralHUBproteins(GZMA、SPP1,TGFBI,FGL2,KNG1,VCAM1和EGF)werediscoveredbyPPInetworksconstructingandtissue-specificfilting.Conclusion:Ourstudyacquired7proteinsbybioinformatics,theseproteinsmaybeunderlyingdiagnosisbiomarkersofdiabeticnephropathy.
【Keywords】diabeticnephropathy；bioinformatics；biomarkers
糖尿病肾病是终末期肾脏病的最常见原因，也是糖尿病的主要并发症之一。早期诊断糖尿病肾病对该疾病的预后有重要意义。目前尿微量白蛋白被认为是诊断糖尿病肾病的早期标志物，但其灵敏度不够。因此通过筛选差异表达的基因，挖掘糖尿病肾病标志物，对于糖尿病肾病的诊断和治疗有重要意义。
基因芯片由于其高通量的特点，广泛应用于基因表达的分析。本文应用生物信息学方法研究基因芯片的表达数据，筛选糖尿病肾病差异表达的基因，构建差异蛋白质的相互作用网络，筛选在肾脏组织特异表达的HUB蛋白质。这些蛋白质可能成为糖尿病肾病的诊断标志物。
1材料与方法
1.1肾组织基因表达数据在GEO数据库中以”diabeticnephropathy”为关键词检索。通过人工判别将GSE30528和GSE30529纳入研究对象[1]。其中GSE30528是研究肾小球基因表达的数据集，22个GSM,正常组13个(GSM757001-GSM757013)，DN组9个(GSM756992-GSM757000)。GSE30529是研究肾小管基因表达的数据集，包括22个GSM,正常组12个（GSM757024-GSM757035），DN组10个（GSM757014-GSM757023）。
1.2数据标准化处理及差异基因筛选将下载的GSE30528和GSE30529应用Array-Tools软件进行过滤和标准化处理。过滤标准为（1）2类样本的基因中位数至少2倍以上的改变，且不少于20%的样本数；（2）基因表达缺失的样本数不超过50%。标准化处理后的数据用ClassComparison工具进行非配对的t检验(P<0.001),筛选出差异表达基因。
1.3差异蛋白相互作用网络的构建
将筛选出的差异基因对应的蛋白名称输入STRING在线软件，得到差异蛋白的相互作用网络。在构建的网络中计算每个差异蛋白的连通度，连通度高的即为HUB蛋白。
1.4肾脏组织差异表达的HUB蛋白生物学功能
进入TiGER数据库，下载肾脏组织特异表达基因库。依据该数据库，在差异蛋白质网络中筛选出在肾脏组织特异表达的差异蛋白。
2结果
2.1差异表达基因
GSE30528数据集得到差异表达基因为906，其中上调689个，下调217个。上调表达最高的基因为LTF，倍数为9.21倍，下调表达最高的基因为CHI3L1,倍数为0.08倍。GSE30529数据集得到差异表达基因为828个，其中上调266个，下调562个。上调表达最高的基因为LTF，倍数为22.99倍，下调表达最高的基因为HRG,倍数为0.14倍。
2.2差异蛋白相互作用网络的构建
依据GSE30528差异表达基因构建的蛋白质作用网络共2260个边，参与蛋白为665个（图1）。GSE30529差异表达基因构建的蛋白质作用网络共3445条边，参与蛋白为634个（图2）。在2个网络中连通度最高的均为VEGF，连通度分别为80和87。
2.3肾脏组织特异表达差异的HUB蛋白
结合TiGER数据库和构建的蛋白质相互作用网络，本研究共筛选到7个肾脏组织特异表达的蛋白质（表1）。分别为GZMA(GranzymeA)、SPP1(Secretedphosphoprotein1)、TGFBI(transforminggrowthfactor,beta-induced)、FGL2(Fibrinogen-likeprotein2)、KNG1(kininogen1)、VCAM1(vascularcelladhesionmolecule1)和EGF（Epidermalgrowthfactor）。这些蛋白质网络中连通度均大于20，是多种代谢和信号通路的关键节点。
3讨论
糖尿病肾病的基本病理改变为肾小球微血管病变和细胞外基质聚集。目前主要诊断指标有尿微量白蛋白、α1微球蛋白和转铁蛋白等微量蛋白[2][3][4]。这些蛋白质由于肾小球基底膜损伤，导致电荷屏障和分子屏障被破坏，血浆蛋白质漏出。当尿微量蛋白出现时，肾小球已经出现了损伤。更早的发现肾脏的微小病理改变变得尤为重要，因此很多研究都在探索糖尿病肾病早期诊断的标志物[5][6]。
肾小球微血管病变和细胞外基质的聚集机制有多种，伴随多种分子的高表达或低表达，这些特异性分子可能成为糖尿病肾病发展过程中的特异标志物。
本文通过研究正常肾脏组织和糖尿病肾病肾脏组织基因表达量的差异，筛选出7种与糖尿病肾病发展过程密切相关的蛋白质，可能成为早期诊断糖尿病肾病的指标。KNG1(kininogen1)激肽原1，激肽原在激肽原酶的作用下释放激肽，从而激活激肽系统，改善肾脏的微循环。在糖尿病肾病组，KNG1的表达明显下降。SPP1(Secretedphosphoprotein1)分泌性磷酸蛋白1，可促进细胞的黏附和迁移。VCAM1(vascularcelladhesionmolecule1)血管细胞粘附分子1，为细胞黏附分子家族成员。选择性的促使单核细胞对内皮细胞的粘附。FGL2(Fibrinogen-likeprotein2),又称纤维介素蛋白2，FGL2的高表达与细胞外基质纤维蛋白的沉积有关，可加速糖尿病微循环障碍，加重肾损害。TGFBI(transforminggrowthfactor,beta-induced)是一种由转化生长因子β诱导的分泌蛋白，为细胞外基质蛋白。EGF（Epidermalgrowthfactor）表皮生长因子，促进上皮细胞增殖、分化，参与组织损伤与修复。可在肾小管合成,在肾衰竭患者中EGF明显降低[7]。GZMA(GranzymeA)粒酶A，为一种丝氨酸蛋白酶，通过诱导PARP1引起炎症反应[8]。
在筛选的7种蛋白质中，KNG1、SPP1和VCAM1通过调节细胞黏附参与肾脏微血管病变的发展。FGL2和TGFBI通过促进细胞外基质的沉积而导致糖尿病肾病的发展。通过筛选出的蛋白功能可以看出，细胞黏附导致的微血管病变和细胞外基质的沉积为糖尿病肾病的主要机制，这与其他的研究相符合[9][10]。目前关于这些蛋白质与糖尿病肾病的关系研究较少，下一步我们将通过生物学实验验证这些潜在标志物在糖尿病肾病发生和发展过程中的变化，以确定能应用于临床诊断的生物标志物。
参考文献：
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基金编号：
重庆市长寿区科委CS2015045