鞘磷脂合酶异常表达与细胞凋亡关系的探讨

论文摘要

鞘磷脂合酶是催化鞘磷脂生物合成的最后一步的关键酶,它以神经酰胺和卵磷脂为底物,催化形成鞘磷脂和甘油二酯。鞘磷脂合酶在人体有两种异构体,分别称为SMS1和SMS2,SMS1主要存在于高尔基体,SMS2主要存在于细胞膜。为判断SMS与细胞凋亡的关系,我们用pcDNA-SMS1和pcDNA-SMS2转染CHO细胞,构建成分别稳定高表达SMS1和SMS2的细胞模型（CHO-SMS1和CHO-SMS2）。Lysenin细胞毒实验和DilC16标记细胞膜实验表明,与野生型CHO细胞相比,CHO-SMS1和CHO-SMS2细胞膜有更高的鞘磷脂含量,也具有更多的去垢剂不溶性膜成分。流式细胞检测,细胞caspase-3 mRNA水平及蛋白水平检测结果表明,TNFα刺激后的CHO-SMS1和CHO-SMS2细胞出现比野生型细胞更高的细胞凋亡。检测细胞内相关脂类含量表明,CHO-SMS1和CHO-SMS2细胞内鞘磷脂、神经酰胺、甘油二酯的含量以及神经酰胺:鞘磷脂比率均显著性升高,而卵磷脂含量无明显改变。我们继续用siRNA干扰THP-1来源的巨噬细胞（TDMC）,SMS1或SMS2 siRNA干扰可显著性降低TDMC细胞的SMS酶比活性,并抑制LPS诱导的TDMC细胞凋亡。脂类测定表明,TDMC分别经各种siRNA处理和LPS刺激后,与对照组细胞相比,SMS1 siRNA或SMS2 siRNA干扰的TDMC细胞内SM和DAG都显著性下降,而卵磷脂和神经酰胺的含量以及神经酰胺:鞘磷脂比率均无显著性改变。Lysenin细胞毒实验表明,SMS干扰后的TDMC细胞膜鞘磷脂含量下降。而用免疫荧光流式细胞技术测定表明,SMS的干扰抑制了LPS刺激后TDMC细胞膜TLR4/MD2复合体的形成。我们的实验表明,在CHO细胞中,SMS的高表达,可能通过神经酰胺的含量增高促进TNFα诱导的细胞凋亡,但不排除DAG升高激活新型PKC介导信号传导的可能。而在TDMC细胞中,SMS的敲减可能影响脂筏的功能、减少TLR4/MD2受体复合体的形成抑制了LPS诱导的细胞凋亡,也可能通过DAG介导信号传导影响细胞凋亡。SMS异常表达与细胞凋亡的深入机制需要进一步研究。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分:稳定高表达SMS1或SMS2的CHO细胞系的建立
• 1.1.前言
• 1.2.材料与方法
• 1.3.结果
• 1.4.结论
• 第二部分:SMS1或SMS2高表达对TNFα诱导CHO细胞凋亡的影响
• 2.1.前言
• 2.2.材料与方法
• 2.3.结果
• 2.4.结论
• 第三部分:SMS1或SMS2高表达对CHO细胞相关脂类含量的影响
• 3.1.前言
• 3.2.材料与方法
• 3.3.结果
• 3.4.结论
• 第四部分:SMS1或SMS2 SiRNA对TDMC细胞SMS酶比活力的影响
• 4.1.前言
• 4.2.材料与方法
• 4.3.结果
• 4.4.结论
• 第五部分:SMS1或SMS2 SiRNA干扰对LPS诱导TDMC细胞凋亡的影响
• 5.1.前言
• 5.2.材料与方法
• 5.3.结果
• 5.4.结论
• 第六部分:SMS1或SMS2 SiRNA干扰对TDMC细胞相关脂类含量的影响
• 6.1.前言
• 6.2.材料与方法
• 6.3.结果
• 6.4.结论
• 第七部分:SMS敲减对TDMC TLR4/MD2受体复合体形成的影响
• 7.1.前言
• 7.2.材料与方法
• 7.3.结果
• 7.4.结论
• 讨论
• 小结
• 后续研究方向
• 参考文献
• 综述
• 附录Ⅰ:本研究中所用到的常规分子生物学实验方法
• 附录Ⅱ:博士期间发表的论文
• 致谢