SCMV-BJ全长cDNA克隆的构建及其部分基因与致病性关系的探索

论文题目: SCMV-BJ全长cDNA克隆的构建及其部分基因与致病性关系的探索

论文类型: 博士论文

论文专业: 植物病理学

作者: 梁新苗

导师: 李怀方,范在丰

关键词: 甘蔗花叶病毒,全长克隆,蛋白,蛋白

文献来源: 中国农业大学

发表年度: 2005

论文摘要: 以接种甘蔗花叶病毒北京分离物(SCMV-BJ)的发病玉米叶片为材料,RT-PCR扩增得到三段部分重叠并覆盖全长的片段,采用拼接的方法获得了T7启动子控制下的SCMV-BJ全长cDNA克隆pSCMV,并将该克隆的体外转录物摩擦接种至健康的玉米植株上。经观察在接种植物上没有出现症状,RT-PCR检测也未能扩增到病毒的CP基因,表明本实验所得到的全长cDNA克隆pSCMV不能够侵染玉米,不具有侵染性。采用RT-PCR方法自SCMV-BJ的基因组中分离出其HC-Pro基因,连接到原核表达载体pET-22b(+)上。获得的重组子pETHC转化大肠杆菌BL21(DE3)后,用IPTG进行诱导表达。SDS-PAGE和Western blot分析表明,HC基因在大肠杆菌中获得了高效表达,产生的融合蛋白分子量约为52 kD,并具有免疫学活性。将融合蛋白纯化后免疫兔子,获得了特异性较高的抗血清并提取了抗体IgG。ACP-ELISA测定抗血清的效价为1/8192。该抗血清可直接用于SCMV-BJ的检测。利用该抗血清,对病毒侵染的玉米叶脉和茎进行免疫胶体金标记,发现在韧皮部筛管的细胞以及细胞的胞间连丝处有金标记,表明HC-Pro参与了SCMV-BJ的细胞间移动以及该病毒的长距离移动。将SCMV-BJ的P1和P3基因分别连接至原核表达载体pGEX4T-3上。得到的重组子pGEXP1和pGEXP3转化大肠杆菌BL21(DE3)后,用IPTG进行诱导表达。SDS-PAGE和Western blot分析表明,这两个基因在大肠杆菌中均获得了高效表达,产生的GST融合蛋白分子量分别为50 kD和64 KD,并且都具有免疫学活性。将融合蛋白纯化后免疫兔子,获得了特异性较高的抗血清。ACP-ELISA测定P1和P3抗血清的效价都为1/8192。分别将SCMV-BJ的HC-Pro、P1和P3基因连接至病毒载体p45p46上,得到了相应的重组载体pPVXHC、pPVXP1和pPVXP3。以线性化的空载体以及重组载体为模板进行体外转录,并将体外转录物接种至本生烟叶片。与空载体p45p45接种的植株相比,pPVXHC和pPVXP3均表现为加重的系统花叶症状,而pPVXP1却没有表现任何症状。通过RT-PCR扩增检测到了HC、P1和P3基因。提取接种叶片的总蛋白,以制备的P1和P3抗血清为一抗进行Western blot检测,结果证明在接种叶片中有P1蛋白和P3蛋白的存在。结果分析表明,HC-Pro可以增强PVX的致病性,但P1蛋白非但未表现这一增强作用,反倒抑制了PVX的致病作用;推测P3蛋白可能通过参与病毒的复制或者是作为症状的决定子来影响症状的表现。

论文目录:

第一章引言

1.1 玉米矮花叶病的研究现状

1.2 马铃薯Y病毒属病毒研究进展

1.3 玉米矮花叶病毒原的分子生物学

1.4 侵染性克隆的研究进展

1.5 植物病毒载体的应用

1.6 VIGS在研究植物功能基因组中的应用

第二章甘蔗花叶病毒全长cDNA克隆的构建及侵染性研究

2.1 材料

2.2 方法

2.3 结果与分析

第三章 HC-Pro基因的原核表达、抗血清的制备及其免疫定位

3.1 材料

3.2 方法

3.3 结果与分析

第四章 P1基因、P3基因的原核表达及其抗血清的制备

4.1 材料

4.2 方法

4.3 结果与分析

第五章 HC-Pro、P1和P3基因在PVX中的表达及其与致病性关系的探究

5.1 材料

5.2 方法

5.3 结果与分析

第六章结论与讨论

6.1 结论

6.2 讨论

参考文献

致谢

作者简历

发布时间: 2005-07-18

参考文献

[1].玉米矮花叶病害问题探讨[D]. 马占鸿.中国农业科学院1999
[2].玉米种子传播甘蔗花叶病毒的研究[D]. 李莉.中国农业科学院2003
[3].玉米矮花叶病病原鉴定、检测及外壳蛋白基因变异研究[D]. 蒋军喜.浙江大学2002

SCMV-BJ全长cDNA克隆的构建及其部分基因与致病性关系的探索

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