论文摘要
豆状带绦虫呈世界性分布,成虫寄生于犬、狐狸等终末宿主的小肠,其中绦期幼虫-----豆状囊尾蚴寄生于家兔等兔形目动物的肝脏被膜、肠系膜及大网膜等处,引起家兔的豆状囊尾蚴病。我国是养兔大国,豆状囊尾蚴病流行于24个省区,是家兔的主要寄生虫病之一。本论文在前人研究工作的基础上,进一步对豆状带绦虫生物学、密码子使用情况及功能基因进行了分析和研究,为兔豆状囊尾蚴病诊断试剂及基因工程疫苗的研究提供候选抗原。主要研究内容与结果如下：1、豆状带绦虫生物学研究观察并记录了5只实验犬在人工感染豆状囊尾蚴后的节片排出特征及虫卵感染家兔后豆状囊尾蚴在兔体内的分布特点,结果显示：5只犬在感染豆状囊尾蚴后的第39～57d开始排出节片,最多一天排出158片。孕节中虫卵含量在60～26,480个之间。平均虫卵大小为（41.32±4.53）μm ×（36.23±4.92）μm。虫卵孵化大约需要4～5min。6只健康家兔每只经口感染5000个虫卵,感染后第55d剖杀。检测发现,豆状囊尾蚴主要寄生部位为兔的胃大网膜和直肠浆膜,肝脏被膜数量则较少。2、豆状带绦虫转录组和包括豆状带绦虫在内的43个扁形动物（吸虫和绦虫）线粒体全基因组密码子偏好性分析利用豆状带绦虫转录组数据库中已注释的8118个重构基因进行了同义密码子使用情况的分析,发现：平均GC含量为49.48%；24个密码子被定义为最优密码子,几乎所有的最优密码子（除CGU外）都以G或C结尾；对应分析中,基因在主轴上与对应的第三位密码子GC含量成正相关,同时编码蛋白基因的表达水平、疏水性及芳香性与有效密码子数（ENC）显著相关。对豆状带绦虫等43个扁形动物（吸虫与绦虫）线粒体基因组密码子偏好性分析发现：19个吸虫纲动物的GC3s平均为0.254±0.044；被测绦虫纲动物GC3s平均为0.254±0.044。四重简并密码子家族碱基组成分析表明：第三位密码子U（51.9%）或A（22.7%）的含量要高C（6.3%）或G（19.14%）的含量；包括UUU, UUA及UUG等,24个密码子是高频使用的密码子；ENC-plot图显示,大多数的点分布在期望ENC曲线的下方或周围；在43个扁形动物中,线粒体蛋白编码基因的核酸组成、基因的疏水性和芳香性都与同义密码子的偏好使用有关。3、豆状带绦虫六钩蚴Tp-UBC2基因的原核表达及重组表达蛋白的功能研究从豆状带绦虫六钩蚴的cDNA中扩增了Tp-UBC2基因。Tp-UBC2开放阅读框全长444bp,编码147个氨基酸。构建了其原核表达载体pET32a-Tp-UBC2,表达的重组蛋白分子量为36.63kDa。经免疫印迹检测,该重组蛋白能与家兔豆状囊尾蚴病阳性血清特异性结合。以80μg纯化的Tp-UBC2重组蛋白及皂素佐剂皮下免疫兔,免疫后7d加强1次,第2次免疫后14d用5000枚豆状带绦虫虫卵口服感染,感染后50d剖检,重组蛋白的减虫率为79.3%。以重组蛋白rTp-UBC2作为包被抗原建立的兔豆状囊尾蚴病Dot-ELISA诊断方法,对226份兔血清的检测结果显示有较高的敏感性（83.3～97.6%）和特异性（88.8-98.4%）。4.豆状带绦虫六钩蚴Tpl基因的原核表达及Dot-ELISA诊断方法的建立。采用RACE技术从豆状带绦虫六钩蚴中扩增出了Tpl基因,Tpl基因全长684bp,编码227个氨基酸,构建了pET32a-Tp1原核表达载体,经IPTG诱导获得分子量约为45.8kDa的重组蛋白。该重组蛋白能与家兔豆状囊尾蚴病阳性血清特异性结合。以重组蛋白Tp1作为包被抗原建立的兔豆状囊尾蚴病Dot-ELISA诊断方法对226份兔血清进行了检测,具有较高的敏感性（92.9～97.6%）和特异性（95.2～98.4%）。5.豆状带绦虫六钩蚴Tp-dUTPase基因的原核表达及Dot-ELISA诊断方法的建立采用PCR方法从豆状带绦虫六钩蚴中扩增得到Tp-dUTPase基因,编码区序列长447bp,编码148个氨基酸。构建了pET32a-Tp-dUTPase原核表达载体,表达的重组蛋白分子量为36.20kDa。该重组蛋白能与家兔豆状囊尾蚴病阳性血清特异性结合。以重组蛋白dUTPase作为包被抗原建立了兔豆状囊尾蚴病Dot-ELISA诊断方法,对226份兔血清进行了检测,结果显示有较高的敏感性（85.7～92.9%）和特异性（86.4～88.0%）。6.豆状带绦虫六钩蚴Tp-TSP2基因生物信息学分析采用PCR方法,从豆状带绦虫六钩蚴中扩增了Tp-TSP2基因,并构建了pET32a-Tp-TSP2原核表达载体。Tp-TSP2基因编码区长621bp,编码206个氨基酸。预测该重组蛋白的相对分子量为52.40kDa,pI值为5.18,有2个B细胞抗原表位,与多房棘球绦虫TSP2基因相似度为92.23%。