论文摘要
研究背景和目的:卵巢癌是妇科恶性肿瘤中发病率占第三位,死亡率占第一位的恶性疾病。在满意的肿瘤细胞减灭术的基础上,辅助紫杉醇+顺铂为主联合化疗的治疗策略虽然明显改善了初治卵巢癌的预后,但是晚期卵巢癌的5年生存率仍然徘徊在15-20%左右。化疗后肿瘤原发或获得性对化疗药物耐药是治疗失败的主要原因之一。目前对肿瘤耐药机制的认识已经相对深入,但是对于临床的指导意义和应用价值却十分有限。已知的耐药相关基因在卵巢癌中的表达不能很好地预测肿瘤的耐药性和预后,mRNA的丰度与其相应的蛋白质水平的表达具有不一致性可能是主要的原因之一。蛋白质组学技术为从蛋白质表达水平深入研究卵巢癌化疗耐药问题提供了可能性。2003年,本课题组受北京协和医院重点基金资助,开展了卵巢癌耐药相关蛋白的比较蛋白质组分析,寻找耐药相关候选蛋白的研究。在通过体外不同给药方式诱导卵巢癌耐紫杉醇细胞株SKOV3,以及获购卵巢癌紫杉醇敏感和耐药细胞株A2780的基础上,采用双向电泳技术（2-DE）,成功制备紫杉醇化疗敏感和耐药细胞株的蛋白质表达图谱。应用比较蛋白质组学技术寻找差异蛋白的表达,筛选获得了高丰度的耐药标记物候选蛋白Cofilin。经Western-blot验证,总Cofilin蛋白在卵巢癌紫杉醇敏感和耐药的细胞间的表达无明显差异,而磷酸化Cofilin（p-cofilin）的表达有显著性差异。经过对24例化疗敏感患者与22例耐药患者的卵巢上皮癌组织切片的免疫组化染色,结果表明,总Cofilin在两组中的表达无明显差别;但化疗耐药组中磷酸化Cofilin的表达明显高于化疗敏感组。进一步的功能研究也表明,候选蛋白Cofilin1可能与卵巢癌细胞对紫杉醇耐药相关。Cofilin是actin（微丝）结合蛋白,控制actin的聚合和解聚。磷酸化cofilin是actin的失活形式,去磷酸化是活化形式。磷酸化和去磷酸化的动态转换是actin行使功能的前提。Actin和紫杉醇的作用靶点tubulin（微管）均是构成细胞骨架的主要成分。细胞骨架的功能主要参与细胞形态的维持,参与细胞内的物质运输和细胞的分裂,参与细胞的运动和收缩,参与细胞的信号转导。本研究在前期工作的基础上,进一步探讨候选蛋白Cofilin的磷酸化过程与紫杉醇作用及耐药的相关性。通过分析Cofilin在体内行使功能与紫杉醇抗肿瘤细胞机制的契合点,探讨应用细胞周期同步化的方法使耐药细胞更多的集中在S期,并同步进入M期,以增强紫杉醇的抗肿瘤效果,改善细胞的耐药性。研究内容及方法:1、卵巢癌SKOV3、A2780紫杉醇敏感和耐药细胞系的细胞形态和生物学特性比较。通过复苏培养已成功诱导三年的卵巢癌耐紫杉醇细胞系SKOV3/TJ2500和A2780/TA2780,采用MTT法,观察其耐药性的维持。进一步对细胞的形态、生长曲线、以及生长周期进行检测。2、针对卵巢癌耐紫杉醇细胞系体外诱导和培养的特性,采用无血清培养法,将紫杉醇敏感和耐药的四种细胞系细胞饥饿培养48小时之后,以不同浓度的紫杉醇作用,在不同时间点收集细胞,提取细胞的蛋白质,以Western-blot法检测,观察去除血清里外源性因素对p-cofilin影响后,紫杉醇对细胞自身p-cofilin表达的影响。3、卵巢癌紫杉醇耐药相关候选蛋白p-cofilin的功能研究。应用真核细胞基因转染技术,将含正义cofilin序列的质粒和cofilin磷酸化位点S用D取代构建质粒,分别转染紫杉醇敏感细胞A2780后,Western blot检测p-cofilin和总cofilin的表达情况;MTT法检测耐药性的改变。4、紫杉醇敏感及耐药细胞周期的同步化对紫杉醇杀伤作用影响的研究。将紫杉醇敏感和耐药细胞用脱氧胸腺嘧啶核苷处理后,分别加入不同浓度梯度紫杉醇,在用药后不同的时间点收集细胞,用流式细胞仪分析细胞周期的变化。以不经同步化处理的细胞为对照,在不同时间点收集细胞,用流式细胞仪检测细胞凋亡的的情况。研究结果:1、MTT法测定的结果显示,紫杉醇敏感细胞系SKOV3和A2780的耐药指数为1,SKOV3和A2780耐紫杉醇细胞系TJ2500与TA2780的耐药指数分别为62.35±11.3和25±6.5。姬姆萨-瑞氏染色的结果提示,耐药细胞TJ2500的多核和畸形核细胞较敏感细胞SKOV3常见。而耐药细胞TA2780形态上改变明显,细胞大部分呈梭形,敏感细胞A2780呈圆形。细胞生长周期的结果提示两种耐药细胞的群体倍增时间均延长。耐药细胞周期中G0-G1期细胞比率均增加,S期比率减少,差异显著,M期细胞比率变化不大。2、采用无血清培养法将紫杉醇敏感和耐药的细胞饥饿培养48小时后,以不同浓度的紫杉醇作用,在不同的时间点收集细胞,Western blot检测的结果表明,紫杉醇敏感和耐药的细胞系均有较高水平的内源性p-cofilin的表达。在经不同浓度的紫杉醇作用后,在一定的时间点,紫杉醇敏感细胞的内源性p-cofilin表达出现下调;随着药物浓度的增加,下调的时间有所延长。而紫杉醇耐药的细胞经过不同浓度的紫杉醇作用后,内源性p-cofilin的表达无明显变化。3、卵巢癌紫杉醇敏感细胞A2780转染正义cofilin质粒后,cofilin及p-cofilin的表达均上调。MTT检测的结果表明,与亲本细胞相比,耐药指数由1上升至11.5～11.8。A2780转染cofilin磷酸化位点替代S3D质粒后,p-cofilin的表达略有下调。与亲本细胞相比,耐药指数由1下降为0.1～0.16。4、低浓度紫杉醇10nmol/l和高浓度100nmol/l用药24小时对细胞周期G2/M期阻滞的影响在SKOV3、A2780中有显著性差异。100nmol/l和1000nmol/l之间的差异不显著。相同浓度紫杉醇随着作用时间的延长,对G2/M期的阻滞作用增加,以用药后24小时最显著。敏感细胞和耐药细胞经细胞周期同步化处理后加入紫杉醇,短时间内撤药,其凋亡率敏感和耐药细胞均较对照组增高,以48小时检测结果差异最显著。研究结论:1、卵巢癌紫杉醇敏感及耐药细胞系SKOV3和A2780经复苏培养,与本课题前期研究的细胞相比,生物学特征无明显的改变。在诱导耐紫杉醇三年后,MTT法测定的结果显示,SKOV3和A2780耐紫杉醇细胞系TJ2500与TA2780的耐药指数分别为62.35±11.3和25±6.5。耐药指数较三年前虽有所下降,但仍良好地维持了其耐紫杉醇的特性。2、采用无血清培养法将紫杉醇敏感和耐药的细胞SKOV3/TJ2500与A278/TA2780饥饿培养48小时后,四种细胞均有较高水平的内源性p-cofilin表达。在经不同浓度的紫杉醇作用后,紫杉醇敏感细胞的内源性p-cofilin的表达出现下调;而耐药的细胞内源性p-cofilin的表达无明显变化。由于磷酸化cofilin是actin的失活形式,去磷酸化是其活化形式,磷酸化和去磷酸化的动态转换是actin行使功能的前提。紫杉醇敏感细胞在药物作用后内源性p-cofilin的表达下调,在细胞总cofilin不变的情况下,意味着更多的cofilin转化成为其活化的形式,驱动actin行使功能,促进细胞的增殖,有利于化疗药物发挥抗肿瘤的作用。耐药的细胞在药物作用后,始终维持内源性p-cofilin的高表达,间接证明了其与卵巢癌细胞对紫杉醇耐药的相关性。3、卵巢癌紫杉醇敏感细胞A2780转染正义cofilin质粒后,cofilin及p-cofilin的表达均上调,细胞的耐药指数上升至。A2780转染cofilin磷酸化位点替代S3D质粒后,p-cofilin的表达略有下调,耐药指数下降。进一步证明了p-cofilin的表达增高与卵巢癌对紫杉醇耐药相关。4、在一定浓度范围内,紫杉醇的作用随药物浓度的增加而提高,达到一定浓度后,这种递增效应减弱或消失,说明紫杉醇作用浓度有饱和效应。其G2/M期阻滞作用随用药时间的延长而增强,以用药24小时最显著。在紫杉醇有效浓度范围内,适当延长药物的作用时间可能会减少耐药性的产生或可成为逆转耐药的方法之一。但耐药细胞的倍增时间明显延长,需要更长的时间才能提高紫杉醇的效果。细胞周期同步化方法有可能成为减少紫杉醇用药时间,加强紫杉醇的作用效果以及逆转耐药性的一个方法。