论文摘要
本研究从生物学特性和分子流行病学两方面对1998～2005年间收集得25株H9N2亚型禽流感病毒（主要是河南地区）的致病力变化进行了比较分析。25株H9N2亚型禽流感病毒经有限稀释法纯化后,在生物学特性方面进行了血凝特性的测定、鸡胚的致病力试验、鸡胚平均死亡时间试验、1日龄雏鸡脑内接种指数试验、6周龄鸡静脉接种指数试验以及8周龄SPF鸡人工感染排毒试验,结果显示:25株H9N2亚型不同毒株间致病力有较大差异,其EID50值在10-6/0.2mL～10-（8.8）/0.2mL之间,ELD50值在10-4.8/0.2mL～10-8.7/0.2mL之间;WDT值在66.5h～103.2h之间;从中选出致病力有差异的8个毒株进行了1日龄雏鸡脑内接种指数（ICPI）、6周龄鸡静脉接种指数（IVPI）以及8周龄SPF鸡人工感染排毒试验,结果证明大部分毒株ICPI和IVPI基本上为0,排毒散毒的高峰期在攻毒后第5天到第6天。在这8株中,A/CK/HN/A3/98（H9N2）（3#）和A/CK/HN/02（H9N2）（18#）表现出了比较高的致病性,不仅其EID50值最高(分别为10-8.8/0.2mL和10-8.8/0.2mL)、ELD50值最高(分别为10-7.9/0.2mL和10-8.7/0.2mL);而且鸡胚平均死亡时间也最短（分别为66.5h和69h）。3#、18#还出现了1日龄雏鸡脑内接种指数（ICPI）（分别为0.238和0.437）和6周鸡静脉内接种指数（IVPI）（分别为和0.34和0.51）;在8周龄SPF鸡人工感染排毒试验中3#和18#毒株的排毒量大,排毒时间也明显长于其它毒株。根据以上的试验结果,25株H9N2亚型禽流感病毒致病性强弱大致可以分为3类:致病性偏强:3#、A/CK/SQ/00（H9N2）（8#）、18#;致病性中等:A/CK/QX/00（H9N2）（13#）、A/CK/SC/01（H9N2）（14#）、A/CK/ZH/01（H9N2）（15#）、A/CK/QX/01（H9N2）（17#）、A/CK/HD/03（H9N2）（20#）、A/CK/QX/04（H9N2）（23#）;致病性较弱:A/CK/HN/A1/98（H9N2）（1#）、A/CK/HN/A2/98（H9N2）（2#）、A/CK/HN/A4/98（H9N2）（4#）、A/CK/HN/A5/98（H9N2）（5#）、A/CK/GZ/99（H9N2）（6#）、A/CK/HN/99（H9N2）（7#）、A/CK/CG/00（H9N2）（9#）、A/CK/XC/00（H9N2）（10#）、A/CK/ZM/00（H9N2）（11#）、A/CK/PY/00（H9N2）（12#）、A/CK/QX/01（H9N2）（16#）、A/CK/HN/02（H9N2）（19#）、A/CK/XZ/03（H9N2）（21#）、A/CK/XZF/04（H9N2）（22#）、A/CK/KF/A1/05（H9N2）（24#）、A/CK/KF/A2/05（H9N2）（25#）。表明我国H9N2亚型不同毒株致病力有明显差异,呈多态性。从不同致病力的毒株中各选两株（3#、18#、17#、20#、6#、10#）有代表性的毒株利用RT-PCR技术扩增其HA基因,并对其序列进行分析比较。结果表明:（1）所扩增的HA基因全长1683bp,编码560个氨基酸.在HA1和HA2的氨基酸裂解位点上有三种模式:RSSR↓GLF、RLSR↓GLF和VSSR↓GLF三种模式,均无出现高致病性禽流感R-X-R/K-R模式,因此均为典型的低致病性毒株。受体结合位点3#、6#、10#、17#、18#为YWTNVLY,潜在糖基化位点除了3#和18#多出一个之外,其余的为8个。（2）6个毒株核苷酸同源性为82.9%～100%,氨基酸同源性为85.6%～99.8%。除了20#之外,其余5个毒株之间核苷酸与氨基酸的同源性都在93%以上。与国内代表株DK/HK/G9/97核苷酸的同源性分别为:96.6%、95.7%、93.3%、95.7%、94.7%、82.5%;氨基酸同源性分别为为96.4%、95.9%、94.9%、95.9%、95.1%、88.0%,表明亲源关系比较近。HA基因系统进化树表明:3#、6#、10#、17#、18#毒株属于欧亚分支,而20#属于北美分支。（3）个别毒株受体结合位点、潜在糖基化位点、裂解位点也发生了变化。其中3#和18#毒株在145aa-147aa多了一个糖基化位点NGT,20#毒株在141aa-143aa和305aa-307aa两处糖基化位点分别为NVT和NIS,在191aa和198aa处受体结合位点为H和E,裂解位点VSSRGLF,与其它毒株不同。3#和18#所表现出较强的致病性可能与其在145aa-147aa多了一个糖基化位点,改变了HA基因空间构型有关,空间构型的改变也会影响其较近的受体结合位点,有可能导致抗原性改变。3#和18#致病力性的增强是否与除HA以外的其它基因的改变有关尚需进一步探讨。该研究结果不仅在病原学和流行病学上丰富了H9N2基础理论,而且为我国政府制定禽流感扑灭政策、有效地防制H9N2流行提供科学的指导,也为生产上H9N2亚型禽流感免疫与制苗毒株的选择提供了参考依据。