紫花苜蓿（Medicago sativaL.）液泡膜Na～+/H～+逆转运蛋白基因MsNHX1的转基因研究

论文摘要

苜蓿是世界上最重要的豆科牧草,种植面积约3500 万hm2。在我国种植面积约130万hm2。与其他豆科牧草相比,苜蓿中蛋白质含量约占干物质总量的17%-20%,其营养价值丰富,是一种极好的饲料作物。然而,随着草场盐碱化程度的加重、草场生态环境的破坏及草场植被的严重退化,需要培育大量的抗逆性紫花苜蓿新品种,来满足草地畜牧业对牧草产量日益增加的需要。采用传统的育种方式培育抗盐碱新品种存在着周期长,见效慢等缺点。利用转基因技术培育紫花苜蓿抗逆性新品种是目前牧草育种中一种较为有效的手段。本文将本实验室从盐胁迫的紫花苜蓿中克隆出的MsNHX1 基因,连接到真核表达载体PBI121 上,构建植物表达载体PBINHX,转入到农杆菌LBA4404 中,分别转化到紫花苜蓿,烟草和拟南芥中,研究该基因的功能和在这些植物中的表达情况。在用叶盘法转化苜蓿的过程中,改进了紫花苜蓿的组织培养方法,筛选到了出愈率,分化率和成苗率均高于80%的高频再生培养体系,为苜蓿转基因工作打下了坚实的基础。同时用抗生素筛选得到转化再生苗。提取再生植株的叶中DNA,进行PCR 检测,结果均呈阳性,初步证实所得再生植株是转基因植株。为了研究MsNHX1 基因在盐胁迫反应中的生理功能,我们构建了MsNHX1 基因的超表达载体,并获得了MsNHX1 超表达的转基因烟草和转基因拟南芥。对MsNHX1转基因烟草在盐胁迫条件下的表现型进行初步分析的结果表明,与野生型相比,转基因烟草种子萌发和植株生长均表现为对NaCl 的抗性增加:在50mMNaCl 处理条件下,未转化MsNHX1 基因的野生型烟草种子的萌发受到强烈抑制,萌发率比转化的降低66%;未转化MsNHX1 基因的野生型烟草植株在200mMNaCl 处理条件下受伤害程度比转化的严重。对转基因拟南芥在盐胁迫条件下的表现型也进行了初步的功能分析,结果表明,转基因拟南芥幼苗对NaCl 胁迫的耐受性增强。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 缩略词
• 1 文献综述:紫花苜蓿转基因研究进展
• 1.1 苜蓿转基因技术研究现状
• 1.1.1 农杆菌介导的基因转化法
• 1.1.2 直接转化法
• 1.2 苜蓿遗传转化研究进展
• 1.2.1 转抗寒,抗旱基因苜蓿
• 1.2.2 转耐盐碱基因苜蓿
• 1.2.3 转抗病虫害基因苜蓿
• 1.2.4 转抗除草剂基因苜蓿
• 1.2.5 苜蓿品质的改良
• 1.2.6 作为植物生物反应器
• 1.3 本研究的目的、意义和内容
• 2 MsNHX1 基因表达载体的构建及其转化
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 基本方法
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 表达载体的构建
• 2.2.2 重组载体的鉴定
• 3 紫花苜蓿高频再生组织培养体系的建立
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 试验材料
• 3.1.2 试验方法
• 3.2 结果与分析
• 3.3 讨论
• 3.3.1 关于胚性愈伤组织的诱导
• 3.3.2 关于胚状体分化的诱导
• 3.3.3 关于植株再生
• 3.3.4 关于高频再生体系的建立
• 4 转 MsNHX1 基因苜蓿的获得及功能分析
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 植物受体材料的准备
• 4.1.2 农杆菌菌株的培养
• 4.1.3 感染和共培养
• 4.1.4 转化体的筛选,继代和植株再生
• 4.1.5 转基因苜蓿的PCR 鉴定
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 接种农杆菌和共培养
• 4.2.2 抗性愈伤组织的筛选
• 4.2.3 抗性愈伤组织的分化
• 4.2.4 体细胞胚的植株再生
• 4.2.5 幼苗锻炼和移栽
• 4.2.6 转基因植株的PCR 检测
• 5 转 MsNHX1 基因烟草的获得及功能分析
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 试验材料
• 5.1.2 试验方法
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 转基因烟草的获得
• 5.2.2 转基因烟草T1 代种子的Kan 抗性分析
• 5.2.3 MsNHX1 过量表达的转基因烟草耐盐性分析
• 6 转 MsNHX1 基因拟南芥的获得及功能分析
• 6.1 材料与方法
• 6.1.1 材料
• 6.1.2 基本方法
• 6.2 结果与分析
• 6.2.1 阳性苗筛选结果
• 6.2.2 PCR 扩增结果
• 6.2.3 转基因拟南芥植株的耐盐性分析
• 7 结论与展望
• 7.1 主要结论
• 7.2 后续研究工作的展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• 独创性声明
• 学位论文版权使用授权书