45S rDNA位点的脆性特质及其调控机制

论文摘要

45S核糖体DNA(45S rDNA)由串联重复元件组成,其编码产物核糖体RNA (rRNA)约占细胞总RNA的80%。rRNA的活跃转录会在细胞核上形成核仁。核仁是rRNA加工成熟并与特定核仁蛋白组装的场所。核仁是被高度调控的结构,它的数目、大小和形态都随着细胞的代谢水平而变化。正常细胞中,只有少部分的45S rDNA拷贝能被转录,其余的拷贝则处于相对沉默的状态。表观修饰参与调控rRNA基因转录失活状态与活跃转录状态的转变。转录沉默相关的浓缩型染色质具有DNA高甲基化、组蛋白去乙酰化以及H3K9me2等表观修饰。相反,活跃转录相关的松散型染色质具有DNA去甲基化、组蛋白H3和H4高乙酰化以及H3K4me2/H3K4me3等表观修饰。为了确保翻译系统的有序性和准确性,45S rDNA序列遵循协同进化模式。但其重复单元内不同区域的进化速率不一致。编码区的序列和二级结构都是高度保守的,而非编码区在物种间存在差异。此外,45S rDNA位点的个数、大小和分布在近源物种中也存在显著差异。该位点串联重复的特质有利于同源重组的进行,因而可能引发这些遗传不稳定性。我们早期的研究表明黑麦草45S rDNA是自发形成的染色体脆性位点。这为研究其遗传不稳定性提供了新的思路。本研究中,我们的结果表明45S rDNA位点既是复制依赖型又是转录依赖型脆性位点。ActD诱导的转录压力会导致不完整的5’ETS转录本的富集和多核仁的形成,并引发一系列表观修饰的改变,包括DNA甲基化和组蛋白H3表达量的降低以及组蛋白乙酰化和H3K4me2表达量的升高。ActD诱导的DSBs会在45S rDNA位点募集大量的yH2AX,但是下游的ecc rDNAs形成则被抑制。此外,我们在Hela和CHO中也发现了高度脱浓缩的45S rDNA脆性表型。这种脱浓缩现象及其引发的断裂与染色体滞后、染色体桥和微核的形成有关。高水平的转录压力可能是这些不稳定现象的驱动力。具体的结果如下：1.复制抑制剂APH和转录抑制剂ActD都能诱导产生植物45S rDNA的脆性表型。中期染色体上,APH诱导的45S rDNA断裂往往出现在端部或近端部,并在染色体上形成空间上完全隔离或仅有少数DNA纤维连接的断裂末端。ActD诱导的45S rDNA异常表型有时也会出现这种末端分布现象,形成明显的断裂位点。但是,大多数情况下,ActD处理会使整个45S rDNA位点都呈现高度拉仲的脱浓缩的脆性表型。45S rDNA脆性位点的细胞学形态类似于人类染色体上的普通型脆性位点的表型。APH和ActD处理也能使间期核上出现45S rDNA的脱浓缩现象,形成弥散的纤维状FISH信号。但是,这两种处理都不能影响玉米着丝粒和Knobs位点的稳定性。2.高水平的转录活性有利于自发形成或ActD诱导的45S rDNA位点的脆性表达。正常黑麦草中,自发形成的45S rDNA断裂位点具有很强的银染信号,而正常的45S rDNA位点几乎没有或只有非常弱的银染信号。类似地,ActD处理过的玉米中,具有脱浓缩脆性表型的45S rDNA位点上有大量AgNOR蛋白的共定位。同时,ActD处理会使玉米细胞内积累大量不完整的5’ETS转录本和出现多核仁现象。这表明,ActD处理在显著抑制RNA Pol I转录延伸的同时会促进rRNA基因的转录起始,从而迫使更多的原本处于浓缩状态的rRNA基因转变成脱浓缩状态并分散在核基质中,形成多核仁。这种转录相关的脱浓缩现象会妨碍中期染色体的折叠,促使45S rDNA位点出现脆性表型。3.大量的表观修饰变化参与调控ActD诱导的玉米45S rDNA位点的脆性表达过程。亚硫酸盐测序的结果表明ActD会诱导出现位点特异性的去甲基化现象。这些特异的位点分别是启动子部位的第16、24、31、35和57位CpG二核苷酸。ChIP结果表明ActD处理会使组蛋白H3的总含量出现大幅度的减少,只占正常含量的11.1%～20.5%。与H3相比,H3K9ac、H3K4me2、H4K5ac和H4K16ac的含量明显升高。相反,H3K9me2的含量却略有下降。这些表观修饰改变可以促使转录沉默的浓缩型染色质(异染色质)转变成活跃转录的松散型染色质(常染色质),最终可能会导致45S rDNA位点的染色质包装失败和脆性表达。4.DNA损伤反应也参与调控ActD诱导的玉米45S rDNA位点的脆性表达过程。yH2AX(?)间接免疫荧光染色的结果表明ActD处理会使多核仁周围出现大量的yH2AX信号。相反,正常核仁周围的信号很弱。ChIP结果也证实ActD处理会使玉米45S rDNA区域的yH2AX含量升高。yH2AX富集现象表明ActD胁迫条件下,有大量DNA断裂出现在脱浓缩的45S rDNA位点。出乎意料的是,定量结果表明ActD处理会使ecc rDNAs的含量略为降低。这表明45S rDNA位点的染色单体内同源重组修复或非同源末端连接修复被抑制。ActD诱导的DNA损伤积累和DNA修复抑制可能会使更多的45S rDNA断裂未经修复就直接进入有丝分裂中期,并在染色体上形成脆性表型。5. FISH结果表明正常培养的Hela和CHO细胞系的中期染色体上也存在少量高度脱浓缩的45S rDNA脆性表型。有丝分裂后期,45S rDNA脱浓缩会使所在的染色体处于滞后状态,甚至会造成后期染色体桥。子代细胞的反向移动会使脱浓缩的45S rDNA位点产生断裂。这种断裂会使所在的染色体片段化,并在细胞核附近形成微核。间接免疫荧光染色的结果证实在不同的细胞周期(间期、中期和后期)都存在yH2AX和UBF的共定位现象。这表明高水平的转录压力可能是造成上述45S rDNA位点不稳定性的主要原因。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1 核糖体RNA基因
• 1.1 核糖体RNA基因的结构
• 1.2 45S rDNA的保守性和不稳定性
• 1.3 rDNA的转录和核仁周期
• 2 染色体脆性位点
• 2.1 脆性位点的概念和类型
• 2.2 脆性位点的分子机制
• 2.3 脆性位点的应答机制
• 2.4 脆性位点的作用机制
• 3 表观遗传机制
• 3.1 表观遗传的概念
• 3.2 DNA甲基化机制
• 3.3 组蛋白修饰机制
• 3.3.1 组蛋白甲基化
• 3.3.2 组蛋白乙酰化
• 3.4 表观遗传修饰的组合调控
• 4 DNA损伤修复通路
• 4.1 DSBs的修复机制
• 4.2 γH2AX信号通路
• 5 本研究的目的和意义
• 第二章 材料与方法
• 1 实验材料
• 1.1 植物材料
• 1.2 细胞系
• 1.3 质粒探针
• 1.4 主要试剂
• 1.5 引物序列
• 2 实验方法
• 2.1 实验材料处理
• 2.2 荧光原位杂交
• 2.2.1 探针制备
• 2.2.2 中期染色体制片
• 2.2.2.1 植物根尖细胞的中期染色体制片
• 2.2.2.2 培养细胞的中期染色体制片
• 2.2.3 原位杂交流程
• 2.3 免疫染色
• 2.3.1 植物细胞核涂片的制备
• 2.3.2 免疫染色流程
• 2.3.2.1 植物细胞核涂片免疫染色流程
• 2.3.2.2 细胞爬片免疫染色流程
• 2.4 银染
• 2.5 实时定量PCR
• 2.6 亚硫酸盐测序
• 2.7 染色质免疫共沉淀
• 2.8 Ecc rDNAs定量分析
• 第三章 结果与分析
• 1 植物45S rDNA位点的脆性表型
• 1.1 APH诱导产生的45S rDNA脆性表型
• 1.2 黑麦草45S rDNA断裂位点的银染结果
• 1.3 ActD诱导的45S rDNA脆性表型
• 2 ActD诱导的45S rDNA脆性机制
• 2.1 ActD诱导的转录异常现象
• 2.2 ActD诱导的多核仁现象
• 2.3 ActD诱导的表观遗传变化
• 2.4 ActD诱导的DNA损伤反应
• 3 动物45S rDNA位点的脆性表型
• 第四章 讨论
• 1 高水平转录的调控作用
• 2 表观遗传机制的调控作用
• 3 DNA损伤修复通路的调控作用
• 4 展望
• 参考文献
• 在读期间发表/待发表的文章
• 致谢
• 作者简介