离子束介导大豆DNA转化羊柴的初步研究

论文摘要

羊柴是我国特有的优良牧草之一,也是防风固沙,改良土壤,改变小气候,改善自然生态环境的优良物种。近些年来由于牲畜的增加,草场重牧,天然羊柴的数量越来越少,甚至在有些地方已经绝迹。利用基因工程对羊柴进行遗传改良具有重要实践意义。目前如何建立一种有效的、稳定的组织培养体系和转化系统,已成为羊柴分子生物学研究和基因工程研究的关键技术。本论文着重研究如何以羊柴成熟胚为外植体建立组织培养体系,并对影响羊柴愈伤诱导率的因素作了初步研究。实验结果表明:以MS为基本培养基,在愈伤诱导培养基中加入2,4-D利于愈伤组织的诱导;加入6-BA可以明显改善愈伤组织的质量。最终确立诱导成熟胚愈伤组织的培养基为MS基本培养基附加2,4-D（2mol/L）和6-BA（1.5mg/L）。本实验针对重组质粒pBI121/Gy3上携带的Kan抗性基因,研究了抗生素的不同浓度对愈伤组织重量增长率的影响,确定了合适的抗生素筛选浓度为60mg/L,建立了有效的筛选体系。在对离子注入羊柴种子的研究过程中发现,离子能量对种子存活率有一定的影响,并通过研究羊柴种子的成活率和剂量的关系确定其转化剂量范围是800、900、1000×2.6×1013N+/cm2,通过实际转化实验确定最佳的转化剂量为900×2.6×1013N+/cm2;对离子束注入后的羊柴愈伤组织进行失水率、愈伤组织重量增长倍数的统计以及细胞存活力的测定,确定了愈伤组织的转化剂量范围是100、150、200×2.6×1013N+/cm2,通过实际转化实验确定最佳的转化剂量为150×2.6×1013N+/cm2。在离子束介导转化实验中,用羊柴干种子和愈伤组织为受体,以GUS基因为筛选标记基因,目标基因为pBI121/Gy3,每个处理组注入约100个种子和20个愈伤组织,在诱导培养基中加入卡那霉素进行筛选,经一个月后得到抗性愈伤组织。GUS检测结果显示:干种子检测到的GUS基因的瞬间表达率为13%。在活体组织注入后可以存活的前提下,通过对离子束介导质粒DNA导入羊柴愈伤组织的遗传体系的研究,得到了GUS基因转入羊柴愈伤组织的抗性愈伤组织,检测到的GUS基因的瞬间表达率为2%。转化体的PCR检测结果表明,筛选出的抗性愈伤组织能扩增出与阳性对照相同的1520bp Gy3亚基的cDNA基因片段,初步证明大豆基因已整合到羊柴基因组中。通过对离子束辅助农杆菌转染羊柴愈伤组织的遗传转化体系的研究,发现在本实验体系下,不经离子注入直接与农杆菌共置的愈伤组织,未得到转化株,而由离子束辅助介导的,转化率高达1%。

论文目录

• 目录
• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 引言
• 1.1 牧草生物技术研究进展
• 1.1.1 国内外牧草生物技术的研究现状
• 1.1.2 转基因牧草研究现状与进展
• 1.1.3 豆科牧草基因转化的研究
• 1.1.4 牧草基因工程存在的问题
• 1.1.5 展望
• 1.2 植物转基因技术简介
• 1.2.1 植物转基因技术原理
• 1.2.2 植物转基因的方法
• 1.2.3 植物转基因技术的应用
• 1.2.4 问题与展望
• 1.3 羊柴研究进展简介
• 1.4 本文的研究意义和主要内容
• 第二章 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 菌株及质粒
• 2.1.3 酶与试剂
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 培养基
• 2.2.2 羊柴种子的消毒
• 2.2.3 愈伤组织的诱导
• 2.2.4 卡那霉素（Kanamycin，Kan）抗性检测
• 2.2.5 甘油预处理
• 2.2.6 离子束注入羊柴种子和愈伤组织
• 2.2.7 离子注入羊柴种子后发芽率和存活率的统计
• 2.2.8 离子注入愈伤组织后失水率、愈伤组织重量增长倍数的统计
• 2.2.9 离子注入愈伤组织后细胞活力的测定
• 2.2.10 质粒 DNA的提取
• 2.2.11 质粒 DNA直接转化羊柴种子
• 2.2.12 质粒 DNA转化愈伤组织
• 2.2.13 农杆菌的培养
• 2.2.14 离子束辅助农杆菌转染羊柴愈伤组织
• 2.2.15 组织化学染色
• 2.2.16 基因组 DNA的提取
• 2.2.17 PCR检测
• 第三章 离子束注入羊柴种子和愈伤组织体系的建立
• 3.1 引言
• 3.2 愈伤组织的诱导
• 3.2.1 培养基的配制
• 3.2.2 诱导方法
• 3.2.3 不同植物生长调节剂对出愈率的影响
• 3.2.4 卡那霉素（Kanamycin，Kan）敏感性检测
• 3.3 离子束注入羊柴成熟种子
• 3.3.1 离子束注入干种子
• 3.3.2 发芽率的测定
• 3.3.3 离子束注入剂量-存活率曲线
• 3.3.4 差异显著性分析
• 3.3.5 正交多项式回归分析
• 3.4 离子束注入愈伤组织
• 3.4.1 离子注入愈伤组织后失水率的统计
• 3.4.2 愈伤组织重量增长倍数的统计
• 3.4.3 细胞存活力的测定
• 3.5 小结
• 第四章 离子束介导质粒 DNA转化羊柴种子及愈伤组织的研究
• 4.1 引言
• 4.2 实验材料
• 4.3 实验方法
• 4.3.1 质粒的中量提取
• 4.3.2 离子束介导质粒 DNA转化羊柴干种子
• 4.3.3 离子束介导质粒 DNA转化羊柴愈伤组织
• 4.3.4 GUS染色
• 4.3.5 转化受体的抗性筛选
• 4.3.6 转化体的 PCR检测
• 4.4 实验结果分析
• 4.4.1 干种子转化结果
• 4.4.2 愈伤组织的转化结果
• 4.4.3 卡那霉素抗性筛选结果
• 4.4.4 转化体的 PCR检测结果
• 4.5 讨论
• 第五章 离子束辅助农杆菌转染羊柴愈伤组织的研究
• 5.1 引言
• 5.2 农杆菌感受态细胞的制备与转化
• 5.2.1 实验材料
• 5.2.2 试剂
• 5.2.3 感受态细胞制备
• 5.2.4 冻融法转化农杆菌 LBA4404感受态细胞
• 5.3 离子束辅助农杆菌介导的羊柴愈伤组织的遗传转化
• 5.3.1 根癌农杆菌的培养
• 5.3.2 转化方法
• 5.4 PCR检测
• 5.5 小结
• 第六章 总结
• 6.1 离子束注入羊柴种子体系的建立
• 6.2 离子束注入羊柴愈伤组织体系的建立
• 6.3 离子束介导质粒 DNA转化羊柴种子及愈伤组织体系的建立
• 6.4 离子束辅助农杆菌转染羊柴愈伤组织
• 6.5 PCR检测
• 参考文献
• 英文符号缩写注释
• 撰写的论文
• 致谢