蔷薇藻活性产物的代谢调控及藻蓝蛋白的分离纯化

论文摘要

蔷薇藻是一种属红藻门的海洋单细胞微藻,内含淀粉核,蔷薇藻在培养过程中能产生胞外多糖、藻胆蛋白和色素等生物活性物质。本文对蔷薇藻培养基中的氮源进行优化,分别以硝酸钾和尿素为唯一氮源,得到二者的最适浓度;分离纯化该藻的藻蓝蛋白,研究了该藻蓝蛋白的氨基酸组成、稳定性以及体外抗氧化活性。得到以下几个方面的结果:1、以硝酸钾为氮源,当含氮量在1.85～296mmol/L之间,蔷薇藻都能保持良好的生长;在最佳含氮量为3.7mmol/L时,生物量和藻蓝蛋白分别提高了5.13%和15.94%;含氮量为296mmol/L时,获得最高胞外多糖产量,提高了254.87%,表明硝酸盐是蔷薇藻的合适氮源。2、以尿素为氮源,含氮量在1.85～29.6mmol/L之间,藻细胞都能保持良好的生长;在最佳含氮量为14.8mmol/L时,生物量、胞外多糖和藻蓝蛋白分别提高了26.92%、23.58%和35.22%;但是当含氮量≥74mmol/L时,藻细胞死亡,表明高浓度的尿素能抑制蔷薇藻的生长甚至有致死作用。3、硝酸还原酶的酶活测定结果表明了该酶与藻的生物量成正相关,且硝酸钾比尿素更能激发该酶的活性。超氧化物歧化酶的活性随着含氮量的增大而升高。4、经两步硫酸铵沉淀和DEAE Sepharose Fast Flow离子交换柱层析后,得到蔷薇藻的纯藻蓝蛋白的纯度为3.92,SDS-PAGE表明该蛋白由两个亚基组成,分子量分别为18和22kDa,氨基酸测定结果表明该蛋白由17种氨基酸组成。5、藻蓝蛋白在pH为中性、低温避光下具有更高的稳定性。6、通过藻蓝蛋白的体外抗氧化实验,得出纯化后的藻蓝蛋白比粗藻蓝蛋白的抗氧化性更强,而且呈剂量依赖效应。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 中文文摘
• 第1章 绪论
• 1.1 前言
• 1.2 蔷薇藻的研究进展
• 1.2.1 蔷薇藻属的定界
• 1.2.2 蔷薇藻属的特征
• 1.2.3 蔷薇藻属的培养、胞外多糖和藻胆蛋白
• 1.3 海藻代谢
• 1.3.1 氮源对海藻生长代谢的影响
• 1.3.1.1 氮饥饿或氮匮乏对海藻生长代谢的影响
• 1.3.1.2 不同氮源及浓度对海藻生长代谢的影响
• 1.3.2 其他因素对海藻生长代谢的影响
• 1.3.3 硝酸还原酶（nitrate reductase, NR）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）
• 1.4 藻胆蛋白
• 1.4.1 藻胆蛋白的基本性质
• 1.4.2 藻蓝蛋白的性质
• 1.4.3 藻蓝蛋白的纯化及鉴定
• 1.4.4 藻蓝蛋白的稳定性
• 1.4.5 藻蓝蛋白的应用
• 1.4.5.1 抗氧化和抗炎症功能
• 1.4.5.2 免疫功能
• 1.5 本论文的研究背景、意义及内容
• 1.5.1 研究背景
• 1.5.2 研究意义
• 1.5.3 研究内容
• 第2章 不同氮源及浓度对蔷薇藻生长代谢的影响
• 2.1 前言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 材料
• 2.2.2 主要试剂
• 2.2.3 主要仪器
• 2.2.4 试验方法
• 2.2.4.1 摇瓶培养的方法
• 2.2.4.2 氮源浓度的设置
• 2.2.4.3 生物量的测定方法
• 2.2.4.4 胞外多糖的测定方法
• 2.2.4.5 藻胆蛋白含量测定
• 2.2.4.6 叶绿素和类胡萝卜素含量测定
• 2.2.4.7 硝酸还原酶（NR）活性测定
• 2.2.4.8 超氧化物歧化酶（SOD）的提取和测定
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 硝酸钾和尿素对蔷薇藻生长代谢的影响
• 2.3.1.1 对生物量的影响
• 2.3.1.2 对胞外多糖的影响
• 2.3.1.3 对藻蓝蛋白的影响
• 2.3.1.4 对叶绿素和类胡萝卜素的影响
• 2.3.2 最佳氮浓度的确定
• 2.3.2.1 对生物量的影响
• 2.3.2.2 对胞外多糖的影响
• 2.3.2.3 对藻蓝蛋白的影响
• 2.3.2.4 对叶绿素和类胡萝卜素的影响
• 2.3.3 硝酸还原酶和超氧化物歧化酶
• 2.4 讨论
• 2.5 本章小结
• 第3章 藻蓝蛋白的分离纯化及性质
• 3.1 前言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 材料
• 3.2.2 主要试剂
• 3.2.3 主要仪器
• 3.2.4 试验方法
• 3.2.4.1 蔷薇藻藻蓝蛋白分离纯化流程
• 3.2.4.2 蔷薇藻藻蓝蛋白粗提液的制备
• 3.2.4.3 蔷薇藻藻蓝蛋白的柱层析分离纯化
• 3.2.4.4 藻蓝蛋白的纯度鉴定
• 3.2.4.5 藻蓝蛋白的氨基酸组成
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 蔷薇藻藻蓝蛋白的分离纯化
• 3.3.1.1 硫酸铵分级沉淀结果
• 3.3.1.2 藻蓝蛋白的柱层析分离纯化
• 3.3.1.3 藻蓝蛋白的纯度鉴定
• 3.3.2 蔷薇藻藻蓝蛋白的氨基酸组成
• 3.4 讨论
• 3.5 本章小结
• 第4章 蔷薇藻藻蓝蛋白的稳定性分析
• 4.1 前言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 材料
• 4.2.2 主要试剂
• 4.2.3 主要仪器
• 4.2.4 试验方法
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 pH对蔷薇藻藻蓝蛋白稳定性的影响
• 4.3.2 温度对蔷薇藻藻蓝蛋白稳定性的影响
• 4.3.3 光照对蔷薇藻藻蓝蛋白稳定性的影响
• 4.3.4 食品添加剂对蔷薇藻藻蓝蛋白稳定性的影响
• 4.3.5 金属离子对蔷薇藻藻蓝蛋白稳定性的影响
• 4.4 讨论
• 4.5 本章小结
• 第5章 蔷薇藻藻蓝蛋白体外抗氧化活性的研究
• 5.1 前言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 材料
• 5.2.2 主要试剂
• 5.2.3 主要仪器
• 5.2.4 试验方法
• 5.2.4.1 抗羟自由基（·OH）能力的测定
• 5.2.4.2 亚油酸自动氧化抑制试验（FOX化验）
• 2^-）能力的测定'>5.2.4.3 抗超氧阴离子自由基（·O₂^-）能力的测定
• 5.2.4.4 总抗氧化（T-AOC）能力的测定
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 蔷薇藻藻蓝蛋白对羟自由基的清除作用
• 5.3.2 蔷薇藻藻蓝蛋白对亚油酸自动氧化的抑制
• 5.3.3 蔷薇藻藻蓝蛋白抗超氧阴离子自由基的能力
• 5.3.4 蔷薇藻藻蓝蛋白的总抗氧化能力
• 5.4 讨论
• 5.5 本章小结
• 结论
• 参考文献
• 攻读学位期间承担的科研任务与主要成果
• 致谢
• 个人简历Curriculm Vita