论文摘要
目的:用不同浓度的肌醇六磷酸（Inositol Hexaphosphate,IP6）以不同时间作用于人结肠癌细胞系HT-29,观察IP6对癌细胞凋亡的影响并对其作用机制进行探讨。方法:1将不同浓度的IP6（0mM、1.8mM、3.3mM、5.0raM、8.0mM、13.0mM）作用于HT-29细胞一定时间（06d）,通过MTT法观察IP6对HT-29细胞的增殖抑制作用;2将不同浓度IP6（0mM、1.8mM、3.3mM）以不同时间（3d、3m、6m）作用于HT-29细胞。用透射电镜观察IP6对HT-29细胞凋亡的作用;流式细胞仪检测IP6对HT-29细胞作用前后的细胞凋亡率的变化;Fura-2/AM法测定IP6作用前后细胞内Ca2+浓度的变化;RT-PCR检测法检测细胞内Caspase-3mRNA的表达;应用免疫细胞化学方法分别检测凋亡相关基因Bcl-2、NF-кB的表达。结果:1 MTT实验结果显示,IP6持续作用能够有效抑制HT-29细胞的增殖,并且具有剂量和时间依赖关系。2透射电镜结果表明,经IP6作用的HT-29细胞发生染色体固缩,电子密度增高,细胞浆浓缩,细胞膜保存完整,可见凋亡小体。3流式细胞术检测结果显示,与对照组相比,各IP6作用组HT-29细胞凋亡率均升高（P<0.05）,并且细胞凋亡率随着IP6作用时间的延长而升高（P<0.05）;其中IP6作用6m时间组的细胞凋亡率与对照组相比有高度统计学意义（P<0.01）。4细胞内Ca2+浓度检测结果显示,IP6各实验组与对照组相比细胞内Ca2+浓度均升高（P<0.05）,并且随着IP6作用时间的延长,细胞内Ca2+浓度升高更明显（P<0.05）。5 RT-PCR结果表明,与对照组相比,IP6各实验组的Caspase-3mRNA表达显著性增高;随着作用时间的延长,Caspase-3mRNA表达有升高的趋势;其中与其他时间组相比,IP6作用6m时间组Caspase-3mRNA的表达显著性升高（P<0.01）。6免疫细胞化学实验结果表明,不同浓度的IP6可以抑制HT-29细胞的Bcl-2蛋白表达,并且随着作用时间的延长,Bcl-2蛋白的表达随之降低（各IP6作用时间组之间相比均为P<0.05）;不同浓度的IP6均可抑制细胞核转录因子NF-кB的表达（P<0.05）,随作用时间的延长,NF-кB蛋白的表达有降低的趋势;与其他IP6作用时间组相比,IP6作用6m时间组NF-кB表达降低有统计学意义（P<0.05）。结论:1 IP6对HT-29细胞的增殖具有明显的抑制作用,并且这种抑制作用具有浓度依赖关系（在IP6作用浓度为0-13.0mM范围内）和时间依赖关系（在IP6作用时间为0-6d范围内）。2 IP6具有促进HT-29细胞凋亡的作用。IP6诱导HT-29细胞的凋亡可能是通过调控细胞信号转导,调节相关凋亡基因的表达来实现的。IP6及其次级磷酸化形式可以促进HT-29细胞胞内Ca2+浓度的增高,从而引发钙超载介导的细胞凋亡活动,这其中包括激活Caspase家族的非活化酶原,引起Caspase-3的级联放大效应,导致细胞内的一系列蛋白底物的裂解作用,促进凋亡的发生。在此过程中,IP6抑制了抗凋亡基因Bcl-2与核转录因子NF-кB的表达,促进细胞凋亡的发生,发挥抗结肠癌的作用。3 IP6促进HT-29细胞凋亡的作用相对缓和,但具有时间效应趋势,提示IP6长期作用可能会更有效的发挥抗结肠癌的功能。
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