论文摘要
甲基丙烯酸环氧丙酯（Glycidyl Methacrylate,简称GMA）作为一种聚合用单体,具有良好的防紫外、耐水和耐热等特性,在树脂、涂料、粘合剂、塑料工业中得到广泛应用。已有研究显示,GMA具有致突变性,并可诱导BALB/C 3T3细胞、金仓鼠细胞（SHE）、正常人胚肺成纤维（KMB-13）细胞等多种哺乳类细胞发生恶性转化,具有潜在致癌性。表观事件的发生与肿瘤的发生发展密切相关,对肿瘤的诊断和治疗具有重要意义。表观遗传学研究的是基因序列不发生改变的可遗传改变,主要通过DNA甲基化和组蛋白甲基化修饰控制细胞的增殖和分化、维持机体的稳定。其中,DNA甲基化作为肿瘤“二次打击”经典假说的重要补充,已经成为新的研究热点之一。大量实验表明,DNA甲基化水平和模式的紊乱在肿瘤发生发展的不同阶段广泛存在,故研究不同时期基因的表达改变及甲基化状态有着极其重要的意义。细胞体外转化试验是研究各种理化因素致癌机制的有效方法。16HBE（human bronchial epithelial cells）细胞是经SV40 Large T抗原永生化的人支气管上皮细胞系,具有正常人呼吸道上皮细胞的形态和功能,该细胞体外易于培养,且裸鼠体内无致瘤性,以其作为转化试验的靶细胞可克服种属和组织学差异,模拟体内细胞受致癌原作用后向肿瘤细胞演变的过程。本研究选用16HBE细胞作为靶细胞,在建立低浓度GMA多次染毒诱导16HBE细胞恶性转化模型的基础上,采用“人类全基因组表达谱芯片”分析恶性转化过程中甲基化相关基因的表达差异,并利用实时定量PCR对部分差异表达基因进行验证,同时采用甲基化特异性PCR（MSP）法检测转化不同阶段肿瘤相关基因的甲基化状态,探讨GMA诱导16HBE细胞发生恶性转化的表观遗传机制。1.GMA致16HBE细胞恶性转化过程中DNA甲基转移酶及甲基化CpG结合蛋白家族基因表达差异分析1.1基因芯片筛选DNA甲基转移酶及甲基化CpG结合蛋白家族表达差异基因利用“人类全基因组表达谱芯片”对转化前期（第10代）和转化后期（第30代）细胞的甲基转移酶及甲基化CpG结合域蛋白家族基因的差异表达进行分析,其中甲基转移酶基因包括DNMT1、DNMT3A及DNMT3B,甲基化CpG结合蛋白家族基因包括MBD1、MBD2、MBD3、MBD4、MECP2、Kaiso,结果显示在转化前期细胞中DNMT1、MBD1、MBD3基因与同代龄DMSO溶剂对照组细胞比较信号比值Ratio≥2,表达均上调,其余基因表达未见无明显差异；转化后期细胞中各基因表达与同代龄DMSO溶剂对照组细胞比较均未见明显差异。1.2 GMA致16HBE细胞恶性转化过程中DNMT1及MBD1基因表达改变对转化前期细胞中DNMT1、MBD1 mRNA表达情况进行进一步研究分析,结果显示：与同代龄DMSO溶剂对照组细胞比较,转化前期细胞中DNMT1及MBD1基因表达分别上调80.60%、79.10%,与芯片结果一致。提示DNA甲基化在细胞恶性转化过程中起着不容忽视的作用,推测DNMT1高表达是GMA致16HBE细胞恶性转化的早期分子事件,DNMT1及MBD1基因可能是多个甲基化相关基因转录表达下调的关键调控点。2.GMA致16HBE细胞恶性转化过程中肿瘤相关基因表达差异分析及DNA甲基化状态的研究2.1 GMA致16HBE细胞恶性转化过程中肿瘤相关基因表达差异分析采用“人类全基因组表达谱芯片”对转化前期、转化后期细胞中肿瘤相关基因表达进行动态分析,结果显示：与DMSO溶剂对照细胞比较,CACNA2D3.LRRC4基因在转化前期、转化后期细胞中表达均下调（0<Ratio≤0.5）; CTGF基因在转化前期细胞中表达上调而转化后期细胞中表达下调；H19、THBS1基因在转化后期细胞中表达下调。2.2 GMA致16HBE细胞恶性转化过程中肿瘤相关基因甲基化状态分析在以往GMA潜在致癌性研究基础上,根据基因表达差异的程度以及相关文献提供的线索,我们挑选了8个基因（P16、APC、LRRC4、H19、hMSH2、MGMT、CTGF、THBS1）,对转化早期（染毒结束）、转化前期、转化后期细胞中这8个基因的甲基化状态进行检测,结果显示P16基因在GMA致16HBE细胞恶性转化不同阶段均出现甲基化现象,可以考虑将其作为GMA致16HBE细胞恶性转化的一个早期敏感指标；hMSH2、CTGF、THBS1基因在转化不同阶段均未出现甲基化现象,提示其并非GMA致16HBE细胞恶性转化的敏感基因；APC、MGMT基因溶剂对照与GMA组均出现不同程度的甲基化,故推断其并非GMA致16HBE细胞恶性转化的特异性基因；LRRC4、H19基因正常对照、溶剂对照与GMA组均出现不同程度的甲基化,其原因尚需进一步研究分析。综上所述,本研究分析了GMA致16HBE细胞恶性转化过程甲基化相关基因的表达差异,并检测了恶性转化不同阶段部分肿瘤相关基因的甲基化状态。结果提示DNA甲基化可能是GMA致16HBE细胞发生恶性转化的一种重要机制；DNMTl及MBD1基因是多个甲基化相关基因转录表达下调的关键调控点,其表达改变可能与肿瘤相关基因的甲基化状态相关,而肿瘤相关基因在不同时期的甲基化状态可作为肿瘤发生发展的一个敏感指标,本研究工作为探讨GMA致癌机制及早期分子标志物的筛选提供了基础,同时也为GMA致癌危险度评定、开展分子流行病学监测、制定卫生标准以及职业肿瘤的防治等实际工作提供参考资料。
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