低氧条件下Stat3反义寡核苷酸对喉癌细胞系Hep-2化疗增敏的分子机制

论文摘要

目的:信号转导子和转录激活子3（signal transducer and activator of transcription 3, Stat3）信号通路在人类多种肿瘤中持续激活,影响肿瘤细胞增殖、凋亡、浸润及转移。本试验通过Stat3反义寡核苷酸转染喉鳞癌细胞系Hep-2,在模拟人体实体肿瘤低氧环境下检测顺铂作用后细胞凋亡、周期及p- Stat3、HIF-1α（hypoxia-inducible factor-1,HIF-1）、VEGF（vascular endothelial growth factor）等相关蛋白表达。探讨低氧对Stat3及相关因子信号传导的作用,以及低氧条件下Stat3反义寡核苷酸对化疗的影响及作用机制。为研发高效低毒的抗癌药物及化疗辅助药物提出理论及方法学依据。方法:1细胞培养环境处理:低氧培养实验条件为37℃、5%CO2、2%O2、93%N2、饱和湿度,对照常氧培养环境为37℃、5%CO2、20% O2、75%N2、饱和湿度。流式细胞技术检测喉鳞癌细胞系Hep-2低氧3h、6h、12h、24h以及常氧对照组p-Stat3、HIF-1α、VEGF的表达。2流式细胞检测细胞常氧和低氧条件下应用浓度为0μg/ml、1μg/ml、3μg/ml、5μg/ml顺铂对Hep-2细胞作用6h后凋亡率。3应用MTT法检测不同浓度（100、200、400nmol/L） Stat3 AS-ON、Stat3 S-ON转染组,脂质体组及未转染组Hep-2细胞作用24h后的细胞存活率。4流式细胞技术检测Stat3 AS-ON（200nmol/L）转染Hep-2细胞24h后低氧条件下顺铂（3μg/ml）作用6小时后细胞周期、细胞凋亡以及p-Stat3、HIF-1α、VEGF蛋白表达。结果:1低氧条件下p-Stat3、HIF-1α、VEGF蛋白表达增强,对照组FI为1,3h、6h、12h和24h p-Stat3 FI值分别为1.04±0.03、1.12±0.03、1.16±0.05、1.12±0.05。HIF-1α对应FI值为0.91±0.32、1.87±0.83、3.91±0.67、5.04±0.51。VEGF对应FI值为1.06±0.14、1.08±0.14、1.71±0.26、2.20±0.75。p-Stat3与已证实的与低氧密切相关的HIF-1α存在正相关关系（r=0.589 p <0.05）,且p-Stat3的表达先于HIF-1α。表明p-Stat3对HIF-1α的表达具有调节作用。2应用流式细胞技术检测Hep-2细胞凋亡率在顺铂浓度为05μg/ml范围内随浓度上升而增加,1μg/ml顺铂作用低氧与常氧组细胞凋亡率无差异（p >0.05）,而3μg/ml、5μg/ml顺铂同等浓度下低氧组肿瘤细胞凋亡率低于常氧组（p <0.01）。表明低氧可以导致化疗抵抗和化疗敏感性降低。3荧光显微镜下各浓度Stat3寡核苷酸转染组均可见绿色荧光。脂质体介导寡核苷酸转染复合物转染30min进入细胞质,1h后80%90%细胞可见细胞核内荧光,同时细胞浆中也有较强的荧光分布,2h后达90%以上。转染24h后MTT检测细胞存活率随Stat3 AS-ON浓度（0400nmol/L）增加下降,与脂质体对照组比较有统计学差异（均为p <0.01）,转染100nmol/L、200nmol/L Stat3 S-ON后细胞存活率与脂质体对照组无统计学差异,而400nmol/L Stat3 S-ON对细胞亦有抑制作用与脂质体对照组比较有统计学差异（p <0.05）。4应用Stat3 AS-ON转染Hep-2细胞24后,流式细胞检测p-Stat3、HIF-1α、VEGF蛋白表达下降,与对照组相比有显著意义（p <0.01）。5流式细胞技术检测低氧条件下Stat3 AS-ON联合化疗组细胞周期出现明显G0/G1期阻滞,S期、G2/M期细胞比例减小。Stat3 AS-ON组也出现G0/G1细胞阻滞。6 200nmol/L Stat3 AS-ON转染Hep-2细胞24h后,3μg/ml顺铂作用于低氧条件6h,流式细胞检测p-Stat3、HIF-1α、VEGF表达下降,对比Stat3 S-ON转染组、化疗组、Stat3 S-ON转染+化疗组、空白对照、脂质体对照组有显著差异（p <0.01）,细胞凋亡率增加,对比其余组别均有统计学差异（p <0.01）。经Pearson相关分析p-Stat3与HIF-1α、HIF-1α与VEGF、p-Stat3与VEGF表达及p-Stat3与凋亡率相关性有统计学意义（均为p <0.01）,（相关系数r分别为0.884、0.667、0.783、-0.909）。结论:1体外试验控制细胞低氧生存环境可检测到在较短时间即出现p-Stat3的表达增高,喉鳞癌细胞系Hep-2中存在由低氧激活的Stat3信号转导。低氧诱导的HIF-1α表达在时效上晚于Stat3信号转导,提示Stat3参与HIF-1α激活过程。2在模拟近似人体实体肿瘤的低氧情况下,通过Stat3 AS-ON转染Hep-2细胞后,阻断Stat3通路,可抑制肿瘤细胞增殖,阻断Stat3信号通路激活,HIF-1α、VEGF亦出现明显下降。说明Stat3通路是低氧诱导HIF-1激活所必须。在缺少Stat3激活的条件下VEGF激活受阻。3 Stat3 AS-ON转染可抑制Hep-2细胞活性,细胞存活率随Stat3 AS-ON转染浓度增加下降,但不能够完全抑制肿瘤细胞的增殖,对细胞凋亡的诱导作用也有一定限度,而且400nmol/L Stat3 S-ON由于高浓度寡核苷酸的非特异性毒性作用对细胞增殖亦表现一定抑制作用。可见寡核苷酸的低毒性、高特异性仍存在局限性。因此不能通过无限制的提高反义寡核苷酸的浓度来提高其杀伤肿瘤的作用。4低氧条件下顺铂诱导细胞凋亡较常氧降低。低氧条件可造成Hep-2细胞G0/G1期细胞周期阻滞,阻断Stat3信号通路后细胞周期阻滞更为明显。应用Stat3反义寡核苷酸转染Hep-2细胞在低氧条件下可不增加顺铂用量明显提高细胞凋亡率,低氧条件下两者联合应用可显著诱导肿瘤细胞凋亡,增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。其化疗增敏作用可能是通过阻断Stat3通路,下调下游抗凋亡因子如Bcl-xl、Mcl-1、survivin实现的。表明靶向Stat3的干扰技术有可能成为喉癌基因治疗的新策略。为临床辅助化疗探索新途径。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 英文缩写
• 研究论文 低氧条件下Stat3 反义寡核苷酸对喉癌细胞系Hep-2 化疗增敏的分子机制
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 附表
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述 Stat3 传导通路的研究进展
• 致谢
• 个人简历