多功能农药降解基因工程菌的构建及其环境释放安全评价研究

论文摘要

农药污染的微生物修复被认为是最具有前景的修复方法之一，然而，由于农药污染种类复杂，迫切需要构建多功能的农药降解工程菌来满足生物修复的需求。工程菌实际应用于农药污染的修复必须具有遗传稳定、不含外源抗性等特点，将外源基因通过同源重组的方法整合到受体菌染色体上是一种理想的方法。另一方面，由于转基因微生物（基因工程菌）的复杂性和不确定性，其环境释放的安全性受到广泛关注，因此，工程菌在应用前必须进行环境释放安全性评价。本研究构建了以sacB基因为反筛选标记的同源重组载体，将外源甲基对硫磷水解酶基因mpd整合到呋喃丹降解菌Sphingomonas agrestis CDS-1的16S rRNA基因（rDNA）位点，构建了遗传稳定、不含外源抗性的能同时降解甲基对硫磷（MP）和呋喃丹的工程菌株，并通过PCR和Southern杂交的方法验证了同源重组事件的发生。mpd基因插入失活一个rrn操纵元对受体菌生理活性和农药降解特性没有负面影响。基因工程菌遗传稳定，经过120代的无选择压力培养，外源mpd基因不丢失。mpd基因整合于rrn位点受到16S rRNA基因强启动子的影响，能增加转录与表达水平，工程菌各个时期内的比酶活均大于出发菌株DLL-1。工程菌即使在外加碳源情况下，能在广泛起始pH、温度、通气量和不同接种量条件下完全降解100mg／kg的MP和呋喃丹农药。构建的基因工程菌株获得农业转基因生物安全管理委员会批准在江苏省进行环境释放的中间试验（农基安办字2003-T285）。为了研究Sphingomonas这类具有重要工业用途和广阔环境修复应用前景菌株的同源重组关键参数，以mpd基因为外源报告基因，不同长度同源臂的同源重组载体为供体DNA和具有不同同源性的Sphingmonas菌株的16S rDNA片段为受体DNA，研究同源重组指导序列的长度和差异性对同源重组效率的影响。结果表明同源臂长度对同源重组的效率影响显著，同源臂最长时同源重组的效率最高，达到5.0±2.10×10-7，当两端的同源臂缩短时，同源重组的效率呈指数下降，Sphingomonas菌株16S rRNA基因位点同源重组的最小片段长度（MEPS）需大于100bp。在Sphingomonas中，发生有效同源重组的供体和受体DNA序列同源性须高于96％。同源重组效率受到序列差异性的显著影响，当供、受体DNA之间存在3-4％的差异性时，同源重组效率相对于100％同源性序列之间下降了3.3到35.7倍。P.putida KT2440菌株中受体DNA与供体DNA之间的同源性为79％，但能在2.8×10-9水平上发生有效同源重组，表明同源重组的效率受到同源性、打靶位点拷贝数和转化效率等多种因素的影响。λRed重组系统能显著提高短同源臂载体的同源重组效率，以99bp的保守16S rDNA序列为同源臂的λRed同源重组载体能够在Sphingomonas agrest CCDS-1、BHC-A和P．putida KT2440中以5.1×10-10～1.1×10-11水平发生有效重组。为提高甲基对硫磷水解酶（MPH）的表达水平，以P．putida KT2440染色体上多拷贝16S rDNA位点为同源重组整合位点，将外源mpd基因多拷贝整合到不同的rDNA位点，分别获得到整合了1-4个mpd基因的重组子。KT2440中7个rrn拷贝中的1-4个被失活，其生长速率与出发菌株相比没有显著差异。同样受rrn位点启动子的影响，mpd基因在rrn位点的整合能提高转录与表达水平，随着mpd基因拷贝数的增加，酶活和比酶活显著增加，KT2440-4mpd最高比酶活达到12.9 mU／μg蛋白，比出发菌株DLL-1提高3.2倍。为延长农药降解基因工程菌剂的货架期，研究了不同载体对菌剂保藏效果，表明草炭的保藏效果最好，可以将液体剂型的20d的保藏期延长到120d，并能维持在109CFU／g载体水平。蛭石的保藏效果较好，是一种比较理想的替代载体。经过120d保藏，在灭菌与未灭菌土壤中投加7.1×107CFU／g干土工程菌均能良好降解50mg&gMP和25mg&g的呋喃丹，MP的降解速率均高于呋喃丹；在灭菌土壤中，两种农药的降解效率快于未灭菌土壤，工程菌数量的下降也较未灭菌土壤慢，在两种土壤中20d和15d后分别检测不到工程菌。为评价基因工程菌的环境释放安全性，在江苏大丰进行了中间试验水平上的安全评价研究。投加1.01×107CFU／g干土的工程菌株在30d时均能完全降解10.71mg／kg的MP和1.29mg／kg的呋喃丹。平板计数表明工程菌在土壤中快速下降；MPN-PCR检测结果显示每克混合土壤中（0-10cm）靶标工程菌在4d，15d和30d的数目分别为2.15±0.98×106，3.70±4.66×104和检测不出。MPN-PCR计数灵敏度要比平板计数法高出1-2个数量级。构建了工程菌Sphingomonas sp.CDS-mpd的特异性荧光原位杂交（FISH）探针，可以专一性的检测到土壤中的靶标工程菌株。三种工程菌检测方法的计数结果表明工程菌在土壤中逐渐消亡，不会成为优势菌，也不会逃逸到释放区外。从土壤可培养微生物三大菌群的计数结果看，工程菌的投加不会对土壤微生物数量产生显著影响。基于通用引物扩增的细菌16S rDNA V3区的变性梯度凝胶电泳（DGGE）分析结果表明农药的施加对细菌菌落结构有显著影响，到60d时细菌群落结构逐渐恢复。工程菌释放在前期对细菌群落结构有一定影响，在工程菌释放后的4d后，相对空白的相似性只有49.57％。在60d时，空白、施药和施菌小区的图谱相似性都在90％以上，表明工程菌释放不会长期影响微生物群落结构，工程菌的释放是安全的。

论文目录

摘要

ABSTRACT

符号与缩略语说明

前言

第一部分文献综述

第一章农药污染的微生物修复研究进展

1 农药污染的微生物修复背景

2 降解农药的微生物及其研究

2.1 降解农药的微生物

2.2 农药微生物降解的代谢途径与降解基因

2.3 农药微生物修复的影响因素

3 农药污染土壤的微生物修复研究

4 农药污染土壤的微生物修复的产业化

5 农药污染土壤的微生物修复的前景与展望

参考文献

第二章鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）细菌综述

1 鞘氨醇单胞菌属的分类和系统发育分析

2 鞘氨醇单胞菌属的生境

3 鞘氨醇单胞菌的分离

4 鞘氨醇单胞菌的培养

5 鞘氨醇单胞菌的鉴定

6 鞘氨醇单胞菌的保藏

7 鞘氨醇单胞菌对化合物的代谢

8 鞘氨醇单胞菌胞外生物多聚物

9 鞘氨醇单胞菌膜结构

10 鞘氨醇单胞菌寡营养类型

11 鞘氨醇单胞菌的遗传学

12 鞘氨醇单胞菌基因组学

13 鞘氨醇单胞菌的生态学

14 鞘氨醇单胞菌的致病性

15 鞘氨醇单胞菌的生物技术应用

参考文献

第三章同源重组研究进展

1 同源重组的类型

2 参与同源重组的蛋白和功能

3 同源重组模型

3.1 Holliday模型

3.2 Meselson-Radding模型

3.3 双链断裂修复模型

3.4 单链退火模型

4 基因打靶实验设计策略

5 同源重组的方式

6 整合载体的整合位点

7 基因打靶技术发展的三个阶段

7.1 自身可作选择标记的特殊基因的同源重组

7.2 采用正负选择（Positive and Negative Selection）系统的同源重组

7.3 对靶位点进行精细操作的同源重组

8 二步选择法中的双交换的反筛选标记（Counter selectable marker）

8.1 镰孢酸（fusaric acid）敏感系统

8.2 链霉素敏感系统（Streptomycin sensitivity system）

8.3 蔗糖敏感系统（The sucrose sensitivity system）

9 同源重组效率的影响因素

9.1 同源重组指导序列（HRDS）长度对重组效率的影响

9.2 同源重组指导序列（HRDS）的同源性对重组效率的影响

9.3 打靶位点的拷贝数与染色体位置

10 Red同源重组系统

参考文献

第四章转基因微生物及其安全评价研究进展

1 转基因生物的发展概况

2 转基因生物的安全性

2.1 生态环境方面

2.2 生物多样性方面

2.3 影响人体健康方面

3 转基因微生物的安全性评价

3.1 转基因微生物的检测与监控

3.2 微生物群落结构与多样性研究

参考文献

第二部分实验部分

第一章遗传稳定多功能农药降解基因工程菌的构建

1 材料与方法

1.1 菌株质粒及培养基

1.2 培养基与培养条件

1.3 试剂与材料

1.4 菌体总DNA的提取

1.5 16S rDNA的PCR扩增

1.6 mpd基因的扩增

1.7 PCR产物的T/A克隆

1.8 E. coli DH5α普通感受态细胞的制备

1.9 DNA酶切反应体系的建立

1.10 质粒DNA的小量提取

1.11 酶切片段回收

1.12 载体脱磷

1.13 酶连

1.14 转化

1.15 16S rDNA的序列系统进化树建立

1.16 二亲接合

1.17 同源重组事件的PCR验证

1.18 同源重组事件的Southern杂交验证

2 结果与分析

2.1 受体菌Sphingomonas agrestis CDS-1基本生物学特性

2.2 CDS-1染色体总DNA的提取及16S rRNA基因的PCR扩增

2.3 同源重组载体的构建

2.4 同源重组子的筛选策略

2.5 同源重组子的获得及同源重组事件的PCR、Southern杂交验证

3 讨论

本章小结

参考文献

第二章影响同源重组效率的关键参数研究

1 材料与方法

1.1 菌株及质粒

1.2 含不同长度同源臂的同源重组载体的构建

1.3 λRed同源重组载体的构建

1.4 λRed同源重组中的二亲接合

1.5 基因序列登录号（Nucleotide sequence accession numbers）

2 结果与分析

2.1 同源片段长度对同源重组效率的影响

2.2 同源重组指导序列差异性对同源重组效率的影响

2.3 λRed重组系统对同源重组效率的影响

3 讨论

本章小结

参考文献

第三章基因工程菌株的生物学和降解特性研究

1 材料与方法

1.1 菌株与材料

1.2 试剂

1.3 培养基

1.4 菌体生长量的测定

1.5 农药提取和检测方法

1.6 菌株生长和降解条件试验

1.7 农药降解影响因素研究

1.8 农药降解广谱性实验

1.9 mpd基因在Sphingomonas agrestis CDS-1染色体上的随机插入

1.10 细胞的高压压榨破碎

1.11 甲基对硫磷水解酶（MPH）酶活测定

1.12 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析

1.13 MPH的酶谱分析

2 结果与分析

2.1 mpd基因在Sphingomonas sp菌株rrn位点的重组对受体菌的影响

2.2 基因工程菌的遗传稳定性

2.3 甲基对硫磷水解酶MPH在工程菌中的表达

2.4 农药降解与菌株生长的关系

2.5 接种量对农药降解的影响

2.6 通气量对农药降解的影响

2.7 温度对农药降解的影响

2.8 初始pH对降解农药的影响

2.9 外加碳源对农药降解的影响

2.10 工程菌Sphingomonas sp. CDS-mpd的农药降解谱

3 讨论

本章小结

参考文献

第四章 mpd基因在Pseudomonas putida KT2440 16S rDNA位点的多拷贝重组

1 材料与方法

1.1 菌株与质粒

1.2 酶活初测

2 结果与分析

2.1 mpd基因在16S rDNA位点的多拷贝重组

2.2 多次位点重组的同源重组效率

2.3 多次重组对菌株生长能力的影响

2.4 多拷贝重组子的稳定性

2.5 不同mpd基因拷贝数重组子的酶活比较

3 讨论

本章小结

参考文献

第五章多功能农药降解基因工程菌剂保藏条件研究

1 材料与方法

1.1 菌株

1.2 载体及来源

1.3 工程菌计数方法

1.4 单一载体吸菌量的测定

1.5 不同剂型保藏试验

1.6 不同接种量保藏试验

1.7 保护剂选择试验

1.8 工程菌剂降解农药的盆钵试验

1.9 土壤中农药的提取和测定

2 结果与分析

2.1 单一载体最大吸菌量试验

2.2 不同剂型的菌剂保藏试验

2.3 工程菌剂接种量对保藏效果的影响

2.4 添加保护剂对保藏效果的影响

2.5 工程菌株降解两种农药的土壤盆钵试验

3 讨论

本章小结

参考文献

第六章工程菌环境释放农药降解效果及定殖动态研究

1 材料与方法

1.1 菌剂与农药

1.2 试验条件

1.3 试验方法

1.4 工程菌的平板计数

1.5 土壤总DNA的提取

1.6 土壤中特异靶标DNA的PCR检测灵敏度

1.7 Most Probable Number-PCR（MPN-PCR）方法

1.8 荧光原位杂交（FISH）

2 结果与分析

2.1 工程菌株对两种农药的降解

2.2 基因工程菌株的平板计数

2.3 土壤总DNA的直接法和间接法提取

2.4 土壤中特异基因的检测灵敏度分析

2.5 环境释放区基因工程菌的MPN-PCR计数

2.6 荧光原位杂交探针的特异性验证

2.7 环境释放区中基因工程菌的FISH检测

3 讨论

本章小结

参考文献

第七章工程菌释放对土壤微生物群落结构的影响研究

1 材料与方法

1.1 培养基

1.2 土壤中可培养细菌、放线菌和真菌的平板计数

1.3 PCR-DGGE实验

2 结果与分析

2.1 工程菌释放对土壤中可培养三大菌群数量的影响

2.2 基于土壤总DNA的16S rDNA V3区的DGGE分析

3 讨论

本章小结

参考文献

全文总结

本论文研究的主要创新点

附录

附录1 实验用培养基及分子生物学试剂

附录2 转基因微生物环境释放相关资料

附录3 DGGE图谱聚类分析的相似性矩阵

附录4 相关载体序列

攻读博士学位期间发表的学术论文

致谢

多功能农药降解基因工程菌的构建及其环境释放安全评价研究

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