SSeCKS在炎症活化星形胶质细胞中作用的初步研究

论文摘要

[研究背景及目的]中枢神经系统（Central nervous system,CNS）内炎症病理过程是以胶质细胞的活化和周围炎症细胞的浸润为主要特征的。作为CNS中数量最多的细胞类型,星形胶质细胞在维持中枢神经系统的稳态方面发挥重要的作用。当机体遭受外来炎症因子或微生物刺激时,星形胶质细胞被迅速激活并产生大量的炎性因子,这些细胞因子具有双向的调节作用:一方面,它们可以诱导更大量炎症因子在中枢神经系统内的产生,例如趋化因子、其它细胞因子、黏附分子等,并由此调节机体对外来刺激的免疫应答过程;另一方面,这些生物活性因子的过度释放会导致反应性胶质增生以及中枢神经系统内环境的破坏,阻碍轴突的再生,影响神经元的活性。因此,对炎症反应的适当调节对于中枢神经系统在免疫应答过程中稳态的维持具有重要的意义。研究表明,多种信号调节机制参与调节星形胶质细胞的活化过程。近几年的研究指出,蛋白激酶C（protein kinase C , PKC）信号途径在星形胶质细胞的激活过程中发挥重要作用,并参与调节星形胶质细胞分化、迁移以及细胞因子的释放等过程。而这种调节作用的发挥主要是依赖于PKC底物的锚定作用对其空间结构以及亚细胞定位的改变。我们所说的AKAP（A Kinase Anchoring Protein）家族的蛋白分子以及蛋白激酶C锚定蛋白就是这种具有锚定功能的蛋白,它们可以作为一种连接蛋白与激酶相结合并将其引导至胞内确定的结构上。本课题的研究对象SSeCKS就是锚定蛋白的一种,该分子最初被认为是有丝分裂的负性调节分子,是PKC的重要底物之一。作为AKAP蛋白家族的一员,SSeCKS的主要效应结构域可竞争性结合纤维状肌动蛋白（F-actin）,钙调蛋白（calmodulin,CaM）,细胞周期蛋白D（cyclinD）,羧基端有蛋白激酶A（protein kinase A,PKA）的结合结构域。因此,SSeCKS可以通过选择性结合一些信号蛋白,整合细胞内信号。Lin等人的研究表明,PKCα可磷酸化SSeCKS并影响其细胞内定位;Kitamura等人发现,在炎症反应过程中,SSeCKS在肺、心脏、肾脏、脑组织中的表达明显增高,故认为SSeCKS是一种炎症反应蛋白;Sae-Won Lee等研究表明,SSeCKS在星形胶质细胞中有表达,并在血脑屏障功能的成熟和维护中发挥重要作用。这些证据提示SSeCKS可能与炎症过程中PKC介导的胶质细胞的活化有关。本研究主要对腹腔注射LPS后SSeCKS在脑组织的表达、定位情况进行了分析,并探讨了该分子在炎症活化星形胶质细胞过程中的作用与相关机制,为中枢神经系统炎症的治疗提供了新的思路。[方法]1.建立LPS致伤大鼠炎症模型。2.运用Real-time PCR、Western blot的方法检测脑组织中SSeCKS表达的时空变化,运用免疫荧光双标,观察SSeCKS在脑组织的细胞定位;分析星形胶质细胞活化与SSeCKS表达水平之间的相关性。3.分离培养并纯化大鼠星形胶质细胞。在细胞水平,运用Real-time PCR、Western blot、激光共聚焦等技术,检测LPS对SSeCKS表达、亚细胞定位的影响;分析炎症刺激,SSeCKS的表达水平以及PKC活性三者之间的相关性。4.运用分子生物学技术构建SSeCKS RNA干扰质粒,转染细胞。运用免疫细胞荧光,Western blot,ELISA,流式细胞仪（Fluorescein activated cell sorter,FACS）,免疫沉淀等方法分析干扰SSeCKS表达对活化过程中星形胶质细胞生物合成以及增殖水平的影响以及相关的信号传递机制。[结果]1. 1)LPS致伤大鼠后早期, SSeCKS在脑组织中反应性表达上调,磷酸化水平增高。2)正常状态下,SSeCKS在脑组织中散在分布,高表达于神经元。LPS腹腔注射后,SSeCKS在星形胶质细胞内表达上调。3)在体外培养的星形胶质细胞细胞中,LPS、IL-1β、TNF-α作用后,细胞内SSeCKS表达水平和磷酸化水平改变;与此同时,SSeCKS在细胞内重新分布:由胞浆向核周迁移,于胞膜足突浓集。PKC的抑制剂可以阻断SSeCKS在细胞内的重排及磷酸化水平的上调。2. 1)LPS可诱导TNF-α在星形胶质细胞内合成,该过程受到PKC-细胞外信号调节激酶（Extracellular signal regulating kinase,ERK）信号途径的调节。2)SSeCKS基因沉默可抑制LPS作用后星形胶质细胞内TNF-α的合成和分泌。3)SSeCKS基因沉默可抑制LPS作用后星形胶质细胞内ERK的活性上调。3. 1)TNF-α能诱导星形胶质细胞增殖。经典型PKC抑制剂G?6976可大幅度阻断该效应,广谱性的PKC抑制剂G?6983或PI3K抑制剂LY294002几乎能完全抑制星形胶质细胞的增殖效应;而新型PKCδ抑制剂Rotterin无明显抑制作用。2)星形胶质细胞增殖水平与SSeCKS的相对磷酸化水平高度正相关（r=0.905,P=0.02）。3)PKC活性的丧失对TNF-α所诱导的Akt的磷酸化无明显影响;同样,抑制PI3K的活性不能影响TNF-α作用后SSeCKS磷酸化水平的上调。PKC-SSeCKS和PI3K-Akt相对独立的影响TNF-α所诱导的增殖信号。[结论]1.正常状态下,SSeCKS在脑组织中散在分布。LPS作用后该分子反应性表达水平和活性均发生改变,提示该分子作为一种炎症反应蛋白,参与中枢神经系统炎症反应。2.炎症因子作用后,SSeCKS在星形胶质细胞内的表达和定位发生改变;其磷酸化水平和细胞内定位的变化依赖于PKC的活性,提示该分子可能参与PKC介导的星形胶质细胞活化信号的传递。3. LPS可诱导TNF-α在星形胶质细胞内合成和分泌,该过程受到PKC-ERK信号途径的调节。4. SSeCKS的表达降低可影响LPS作用后星形胶质细胞内ERK磷酸化水平的上调和TNF-α的合成与分泌。提示该分子可能作为一个中介分子影响炎症信号从PKC到ERK的传递。5. SSeCKS参与调节TNF-α诱导的星形胶质细胞的炎性增殖过程。TNF-α刺激后SSeCKS的广泛磷酸化可能是促成星形胶质细胞的增殖的原因之一。6. PKC-SSeCKS和PI3K-Akt均能影响TNF-α所诱导的增殖信号的传递,它们之间没有明显的上下游关系,但却能互相牵制,提示PKC-SSeCKS和PI3K-Akt信号通路可能在下游存在交集。

论文目录

• 英文缩略词表（Abbreviation）
• 中文摘要（Abstract in Chinese）
• 英文摘要（Abstract in English）
• 第一部分LPS 致伤大鼠星形胶质细胞内SSeCKS 表达的研究
• 前言（Introduction）
• 材料和方法（Material and Method）
• 结果（Results）
• 讨论（Discussion）
• 结论（Conclusion）
• 参考文献（References）
• 第二部分 SSeCKS 与炎症诱导星形胶质细胞生物合成行为的相关性研究
• 前言（Introduction）
• 材料和方法（Material and Method）
• 结果（Results）
• 讨论（Discussion）
• 结论（Conclusion）
• 参考文献（References）
• 第三部分 SSeCKS 与炎症诱导星形胶质细胞增殖行为的相关性研究
• 前言（Introduction）
• 材料和方法（Material and Method）
• 结果（Results）
• 讨论（Discussion）
• 结论（Conclusion）
• 参考文献（References）
• 综述（Review）
• 致谢（Acknowledgements）
• 附录一 所获表彰（Rewards）
• 附录二 已发表文章（Published Articles）