甜瓜果实醇酰基转移酶基因表达分析与功能鉴定

论文摘要

甜瓜（Cucumis melo L.）是世界上重要的园艺作物之一,香气作为甜瓜品质的重要指标在一定程度上影响了消费者的购买欲望。挥发性酯类物质是构成成熟甜瓜特征香气最重要的成分之一,醇酰基转移酶（AAT）是甜瓜挥发性酯类物质合成途径中的关键酶。为了研究甜瓜酯类合成与调控机制,本研究进行了对该基因在甜瓜果实不同发育时期及1-甲基环丙烯（1-MCP）、水杨酸（SA）、乙烯利（ETH）诱导下的表达特性分析;并以厚皮甜瓜M01-3自交系和番茄自交系Pr1为试验材料,分别采用子房注射法和农杆菌介导法将anti-AAT2基因转化甜瓜和番茄,对获得的转基因甜瓜和番茄进行了AAT2基因的表达、AAT酶活性、生长势和果实品质等指标的测定。本研究旨在探明AAT基因在甜瓜果实发育和酯类代谢过程中的功能,为利用分子生物学手段进行甜瓜品质育种提供理论依据。主要结果如下:1. AAT基因表达特性分析及酶活性测定Real time quantitative RT-PCR的结果显示,AAT1和AAT2在甜瓜果实香气的合成中起主要作用,1-MCP能够抑制甜瓜AAT基因的表达以及AAT酶的活性,尤其是在基因表达高峰期。SA和ETH能在不同程度上诱导AAT基因的表达,ETH能够诱导AAT1,AAT2,AAT3和AAT4的表达,SA能够诱导AAT1和AAT2的表达,对AAT3和AAT4诱导效果不明显。2.反义AAT2基因对甜瓜的转化与对照相比转基因果实AAT2基因的表达受到明显抑制,转基因果实AAT2基因的表达平均仅为对照的20%,其中T0-3受到抑制最大,表达量仅为对照的12.6%。AAT酶活性相应降低,但是降低效果不如基因表达明显,可能是因为AAT基因是一个基因家族,存在其它AAT基因调控该酶的最终活性。对转基因植株的生长势进行了测定,结果显示T0代的3株转基因植株光合作用与对照相比都有所降低、株高茎粗都明显小于对照植株,在果实膨大期转基因植株的平均株高仅为对照的80%,光合作用仅为对照的88%。3.反义AAT2基因对番茄的转化为了确定转反义AAT2基因对番茄果实挥发性成分的影响,以红熟期番茄果实为研究对象,用SPME-GCMS分析了转基因和对照果实挥发性物质成分。结果显示3-甲基丁醇、己醇、己醛、顺-3-己烯醇和6-甲基-5-庚稀酮的含量有所上升。转基因果实中,AAT2基因在果实发育过程中的表达趋势与对照番茄果实相同,且表达量比对照降低,这表明anti-AAT2基因对甜瓜果实AAT2基因起到了不同程度的抑制作用。转基因番茄植株的生长势与对照植株相比同样有弱小的现象。转基因番茄果实的糖酸比略有下降,维生素C含量平均只有对照植株番茄的83.61%。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 引言
• 1.1 甜瓜的香气成分
• 1.2 醇酰基转移酶在酯类挥发性成分合成中的作用
• 1.3 醇酰基转移酶基因及表达调控
• 1.3.1 植物中醇酰基转移酶基因
• 1.3.2 植物中醇酰基转移酶基因的调控
• 1.4 转基因技术
• 1.4.1 农杆菌介导的基因转移
• 1.4.2 子房注射法
• 1.5 反义 RNA 技术
• 1.5.1 反义RNA 技术的概念
• 1.5.2 反义RNA 技术在植物中的应用
• 1.5.3 反义技术的研究展望
• 1.6 荧光定量PCR 技术在植物基因工程中的应用
• 1.6.1 荧光定量PCR 技术原理及定量方法
• 1.6.2 实时荧光定量PCR 的应用前景
• 1.7 本研究的目的和意义
• 2 试验材料与方法
• 2.1 试验材料及试剂
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 试剂
• 2.1.3 引物
• 2.1.4 培养基
• 2.2 试验处理
• 2.3 试验方法
• 2.3.1 基因组RNA 的提取
• 2.3.2 反转录cDNA 第一链的合成
• 2.3.3 荧光定量 PCR
• 2.3.4 醇酰基转移酶酶活测定
• 2.3.5 子房注射法转化甜瓜
• 2.3.6 农杆菌介导法转化番茄
• 2.3.7 PCR 法筛选转基因阳性植株
• 2.3.8 转基因番茄果实挥发性气体含量测定
• 2.3.9 转基因植株叶片叶绿素含量的测定
• 2.3.10 转基因植株果实功能叶日均光合速率的测定
• 2.3.11 转基因番茄果实糖酸的测定
• 2.3.12 维生素 C 含量测定
• 3 结果与分析
• 3.1 甜瓜果实总RNA 的提取
• 3.2 甜瓜果实发育期醇酰基转移酶基因的表达调控分析
• 3.2.1 1-MCP 对甜瓜果实醇酰基转移酶基因表达及酶活性影响
• 3.2.2 ETH 和 SA 对甜瓜果实醇酰基转移酶基因表达及酶活性影响
• 3.3 AAT2 反义基因对甜瓜的转化
• 3.3.1 利用子房注射法对甜瓜进行遗传转化
• 3.3.2 AAT2 在转基因果实中的表达分析
• 3.3.3 T0 代转基因植株生长势及光合速率测定
• 3.4 反义 AAT2 基因对番茄转化的研究
• 3.4.1 PCR 法鉴定转基因植株
• 3.4.2 T1 代转基因番茄果实发育期酶活性分析
• 3.4.3 转基因番茄挥发性气体成分
• 3.4.4 转基因植株株高、茎粗、光合作用和叶片叶绿素含量的测定
• 3.4.5 转基因番茄果实品质测定
• 4 讨论
• 4.1 醇酰基转移酶基因在1-MCP、ETH和SA诱导下的表达特性分析
• 4.2 转基因果实AAT2 的表达及酶活性的变化
• 4.3 醇酰基转移酶对植物挥发性物质组成和含量的影响
• 4.4 转入甜瓜 anti-AAT2 改变了番茄果实品质和植株生长
• 5 结论
• 5.1 甜瓜果实AAT 基因表达特异性分析及酶活性测定
• 5.2 反义AAT2 基因对甜瓜的转化
• 5.3 反义AAT2 基因对番茄的转化
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间完成的学术论文
• 硕士学位论文内容简介及自评