人源Fab噬菌体抗体库的构建及抗IL-4抗体的初步筛选

论文摘要

背景和目的：白细胞介素-4（interleukin-4. IL-4）足20叶纪80年代初发现的,是具有多种生物学功能的一种细胞因子。主要由活化的TH2细胞及肥大细胞等产生。IL-4在炎症的发病机制中起着重要的作用,IL-4作为TH2细胞的特征细胞因子,在以Th2为特征的炎症反应中促进其发生发展,其促炎的途径有多种。IL-4虽然在炎症发生发展中有重要作用,但其广泛的生物学功能使其在许多疾病治疗中也起到作用,特别在肿瘤,白血病、自身免疫性疾病治疗中都有较好的效果。研究表明IL-4不仅可以治疗许多疾病,同样IL-4也可以导致一些疾病的发生,在一些疾病的发生发展中起了重要作用,如哮喘,过敏性疾病,肾小球疾病,卵巢癌等肿瘤,脑梗塞等疾病[2-5]。IL-4在上述疾病中都有不同的变化,这种变化对这些疾病有很大的影响。因此检测其在人体内的变化是研究IL-4与疾病关系的重要手段。目前许多基因工程抗体已经用于临床研究,如Rutgers等从噬菌体抗体库中筛选得到β淀粉样蛋白抗体。同样如果通过基因工程制备出IL-4抗体,对临床疾病的诊治也会有好处。现存的检测IL-4的主要方法是酶免疫检测法。这种方法是用动物源性单克隆抗体包被ELSIA板来检测IL-4。但通过杂交瘤技术得到的抗体,无法避免抗体异源性的问题,给检测带来了误差。而且传统方法制备的抗体存在量少,工作繁琐,周期较长等问题,给（?）研究IL-4带来了困难。因此快速,有效制备出人源化的抗体成为了亟待解决的问题。噬菌体抗体展示库技术的出现为人源抗体的制备提供了新的思路,使快速获得人源抗体片段成为可能,噬菌体抗体库技术源于基因工程技术,它是将人抗体基因片段组装到载体内,然后展示到噬菌体表面得到多样性噬菌体抗体的集合即为人源噬菌体抗体库最初由Clackson等阐述,从抗体库中就可快速筛选到人源化的抗体,抗体库技术是一种筛选高质量人源性抗体的稳定而简便的技术。这种技术不经免疫,绕过杂交瘤技术,直接利用抗原从抗体库中筛选特异性抗体,较好地解决了人杂交瘤技术低效及人体排异反应的难题。本研究采用噬菌体表面展示技术在本室构建的抗体库的基础上进行了变化,重新构建了一个库容量大、多样性好的人源Fab噬菌体抗体库,搭建了人源抗体制备技术平台,用于制备IL-4抗体,为下一步进行抗体的表达、纯化、大量制备以及进一步的临床应用研究提供必要的前提。方法：从正常健康成人的外周血中分离淋巴细胞,提取总RNA,以逆转录PCR （RT-PCR）（?）去扩增人抗体重链Fd段和轻链基因。轻链扩增产物和噬菌粒载体pComb3XSS分别经SacⅠ/XbaⅠ双酶切,由T4 DNA连接酶连接,电穿孔转化感受态大肠杆菌XLl-Blue,扩增后提取噬菌粒,构建轻链库。轻链库质粒经SacⅠ/XbaⅠ酶切鉴定。轻链库噬菌粒DNA和重链Fd段扩增产物经XhoⅠ/SpeⅠ双酶切,以同样方法连接后转化XL 1-Blue,加入辅助噬菌体VCSM13,构建Fab噬菌体抗体库。随机挑取若干单克隆酶切鉴定基因片段的插入；并以提取的噬菌体抗体库噬粒DNA为模板,以轻、重链不同引物组合进行PCR扩增。以IL-4为抗原对构建的抗体库进行5轮筛选。Phage-ELISA鉴定IL-4特异性噬菌体抗体,并选取阳性克隆测定轻链、重链（Fd） DNA（?）序列,进行同源性分析。结果：构建的人源Fab噬菌体抗体库库容为2.4×108,酶切和PCR鉴定插入基因片段大小正确,以IL-4为抗原对抗体库进行5轮筛选得到了340倍的富集,Phage-ELISA鉴定阳性克隆有抗原结合活性。阳性克隆结果显示,阳性克降重链核苷酸序列与人免疫球蛋白Y链同源性为91%,轻链核苷酸序列与λ链序列同源性为94%。结论：成功构建了一个人源Fab噬菌体抗体库,为今后筛选制备各种抗体奠定了基础。初步获得了抗IL-4-Fab抗体,为以后IL-4抗体的表达与纯化以及后续的大量制备提供了先决的条件,进而为进一步研究IL-4与疾病的关系做好准备。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 缩略语/符号说明
• 前言
• 研究现状、成果
• 研究目的、方法
• 一、人源Fab噬菌体抗体库的构建及鉴定
• 1.1 对象和方法
• 1.1.1 对象
• 1.1.2 PCR引物
• 1.1.3 主要仪器
• 1.1.4 实验流程
• 1.1.5 方法
• 1.2 结果
• 1.2.1 外周血淋巴细胞总RNA的提取
• 1.2.2 18SrRNA内参照的扩增结果
• 1.2.3 轻链基因和重链Fd段的PCR扩增结果
• 1.2.4 噬粒pComb3XSS的鉴定
• 1.2.5 轻链库的构建与鉴定
• 1.2.6 辅助噬菌体VCSM13的扩增和滴度测定
• 1.2.7 噬菌体Fab抗体库的构建和鉴定
• 1.3 讨论
• 1.3.1 噬菌体抗体库的发展历史
• 1.3.2 构建噬菌体抗体库的先决条件及注意事项
• 1.3.3 辅助噬菌体的作用与扩增
• 1.3.4 噬菌体抗体库的机遇和挑战
• 1.4 小结
• 二、抗IL-4抗体的筛选与鉴定
• 2.1 对象和方法
• 2.1.1 对象
• 2.1.2 主要仪器
• 2.1.3 试验流程
• 2.1.4 方法
• 2.2 结果
• 2.2.1 IL-4特异性抗体的筛选
• 2.2.2 Phage-ELISA检测噬菌体抗体
• 2.2.3 阳性克隆的测序结果
• 2.3 讨论
• 2.3.1 IL-4抗体筛选过程中的问题
• 2.3.2 筛选抗体的检测
• 2.4 小结
• 结论
• 参考文献
• 发表论文和参加科研情况说明
• 综述 噬菌体抗体库技术的研究进展
• 综述参考文献
• 致谢