作者简介：肖正球（1998年5月-），男，本科，长沙医学院在校生，研究方向：生化与分子学
通讯作者：赵娟（1984年7月-），女，讲师，长沙医学院教师，研究方向：生化与分子学，E-mail：176797282@qq.com
项目编号：2018年度长沙医学院大学生研究性学习和创新性实验计划项目-长医教[2018]77号-217；湖南省科技厅项目（湘科规材[2016]8号），创新平台编号：2016TP1029
（长沙医学院湖南长沙410219）
摘要目的分析骨形态发生蛋白9对脂肪肝细胞进行定向分化的诱导效果。方法本实验采用清洁级新西兰大白兔脂肪干细胞进行培养与分化，根据培养条件分为三组：分别是空白对照组（普通地塞米松）、条件对照组（含钙元素的地塞米松）、实验组（含钙元素的地塞米松联合骨形态发生蛋白9），分析不同诱导环境下，三组细胞定向分化的差异。结果培养后比较，RUNX2、OCN、MiR-144-3p表达含量的差异均表现出统计学意义（P<0.05），两两比较，条件对照组和空白对照组、实验组和空白对照组、实验组和条件对照组之间的差异均有统计学意义（P<0.05）。结论脂肪干细胞在特定环境（钙元素的地塞米松联合骨形态发生蛋白9）中可以定向分化为骨骼，表现为相关特征基因（RUNX2和OCN）的高含量表达。
关键词脂肪干细胞；特定条件下；定向分化；骨骼；骨形态发生蛋白9
骨骼肌长期以来均被视作卫星细胞或者肌前体细胞的必要来源，这些细胞在正常情况下处于静息状态，当肌肉组织受损时被激活，进而分化并彼此融合成为新的肌纤维，从而达到修复受损肌肉的目的。同时，卫星细胞还能够分裂出新生细胞来维持骨骼肌中未分化细胞的数量[1]。然而，尽管卫星细胞具有取材容易且再生分化能力强的优点，但其只能单向分化为肌细胞的特性在临床应用时却具有明显的局限性[2]。骨骼肌中还存在另外一种和卫星细胞有明显区别，即含有分化为多种细胞能力的脂肪细胞。但是不同研究均证实，这些脂肪细胞需要在特定条件下才能进行再次定向分化，因此研究脂肪干细胞的潜力越来越受到众多学者的重视。
1对象与方法
1.1细胞与试剂
（1）实验细胞：本实验采用清洁级新西兰大白兔脂肪干细胞进行培养与分化，根据培养条件分为三组：分别是空白对照组（普通地塞米松）、条件对照组（含钙元素的地塞米松）、实验组（含钙元素的地塞米松联合骨形态发生蛋白9）每组细胞为20孔板。
（2）试剂仪器：DMEM培养液、胎牛血清、ALP活性检测试剂盒、CO2细胞培养箱，OLYMPUS倒置显微系统、地塞米松、p甘油磷酸钠、维生素C、WesternBlottingECL化学发光检测试剂盒、罗氏LightCycler480荧光定量PCR仪、smad4与pActin抗体、MicroRNA
ReverseTranscriptionkit试剂盒。
1.2细胞复苏：由液氮罐中迅速取出冻存的细胞，至于37℃水浴锅解冻，然后接种于一次性细胞培养瓶，加入新鲜DMEM培养液5mL，放人5070CO：培养箱内37℃培养，每2d换液1次。当贴壁细胞融合度达到预设条件，再进行传代（用0.25%的胰酶消化）。
1.3成骨诱导分化：加入细胞成骨分化诱导培养液，放人37℃的CO2培养箱培养和细胞成骨分化诱导，每3d更换1次新鲜的成骨诱导培养液，整个成骨诱导过程持续3周时间，显微镜下观察细胞的生长状况以及形态变化[2]。
1.4基因表达的检测：对抽提的RNA进行体外反转录实验，得到cDNA产物；反应条件为：16℃，孵育30min，42℃孵育20min，85℃加热5min，4℃伤鲜≠。以得到的cDNA为模
版，进行荧光定量PCR，采用TaqMan圆UniversalPCRMasterMix20yL反应体系，在罗氏LightCycler480仪器上操作，以U6作为表达检测的内参，ACT表示miR-144-3p的相对表达量、△CT表示Runx2的相对表达量、ACT表示Smad4的相对表达量[2]。
1.5统计学处理：采用SPSS22.0进行数据分析，计量资料经检验均服从正态性分布，采用（）进行描述，组间比较采用独立样本F/t检验，培养前和培养后比较采用配对设计资料的t检验。检验水准0.05，双侧概率。
2结果
2.1三组干细胞培养前后特征性基因表达含量的比较
三组干细胞培养前比较，RUNX2、OCN、MiR-144-3p表达含量的差异均无统计学意义（P>0.05）。培养后比较，RUNX2、OCN、MiR-144-3p表达含量的差异均表现出统计学意义（P<0.05），两两比较，条件对照组和空白对照组、实验组和空白对照组、实验组和条件对照组之间的差异均有统计学意义（P<0.05）。
3结论
近来，越来越多研究表明，骨形态发生蛋白9可能不只是疾病早期诊断和预后判断的生物标记，其还参与了生物体组织生理的调节。比如骨质疏松性患者骨折后短期循环中骨形态发生蛋白9含量的变化可能会对骨代谢和骨折愈合过程造成重大影响。
研究发现，培养后比较，RUNX2、OCN、MiR-144-3p表达含量的差异均表现出统计学意义，这与骨形态发生蛋白9激活了细胞分化通路，从而导致分化细胞中特定基因表达含量增加有关。成熟的microRNA-17-92家簇成员靶向抑制DKKI激活Wnt/p-catenin信号通路，从而促进成骨分化，DKKI主要通过抑制Wnt信号通路、成骨分化以及促凋亡因子BIM的水平维持骨代谢稳态。另外，成骨细胞特异性敲除DICER导致骨量增高。进一步研究发现，条件性敲除小鼠的骨膜组织中microRNA-17-92家簇的下游靶基因Runx2和骨膜蛋白表达水平显著增加，表明DICER/microRNA-17-92家簇/Runx2、骨膜蛋白信号通路在骨代谢过程中发挥重要作用[3]。
脂肪干细胞是骨组织工程热门的种子细胞之一，最主要的原因是脂肪干细胞具有取材方便、低免疫原性、成骨分化的能力等特性。脂肪干细胞成骨分化的主流方法仍是化学诱导法。我们本实验虽然实现了脂肪肝细胞的定向分化，但鉴于脂肪干细胞在骨组织工程中的重要性，有以下两个方面是亟需解决的：第一，探索不同种属脂肪干细胞成骨诱导培养液各组分的最佳浓度。第二就是分析细胞供体动物的年龄、健康状态、脂肪取材部位、细胞代数对定向分化结果的具体影响。
参考文献
[1]龙志成.HA/β-TCA复合体及同种异体骨与脂肪干细胞复合后治疗兔脊柱骨缺损的对比研究[D].新疆医科大学，2017.
[2]刘琴，陈芳，王丽平，等.脂肪干细胞成骨分化的研究进展[J].中国实验动物学报，2017，25（5）：581-586.
[3]谢嘉清，齐新文.脂肪干细胞治疗脊髓损伤的移植途径及机制[J/OL].医学综述，2018（19）：3766-3771.