EIAV疫苗株gp90基因的多克隆构成和体内进化与免疫保护的相关性

论文摘要

中国马传贫（EIA）弱毒疫苗,是可良好诱导针对慢病毒的免疫保护并唯一被成功大规模应用的慢病毒疫苗。明确EIA弱毒疫苗致弱和诱导免疫保护的机制,将对慢病毒免疫机制研究和制定疫苗研制策略提供有益的参考。本文选择中国EIA驴胎皮细胞适应性弱毒疫苗EIAVFDDV为研究对象,对该弱毒疫苗的病毒种群构成和体内复制特点及二者与诱导免疫保护的相关性进行了探讨。使用RT-PCR和克隆测序技术,对EIAVFDDV gp90基因的多样性进行了分析。随机获得的52个gp90基因的不同克隆,同源率在96%-100%不等,推导的氨基酸序列差异最高可达6.5%。该差异结合进化树和推导的氨基酸序列的聚类分析结果,提示经过无宿主特异性免疫压力的长期体外传代培养得到的EIAVFDDV ,其病毒种群存在着丰富的基因多样性、呈混合构成状态。我们将该构成特性,称作“多克隆构成”。通过分析免疫成熟过程中不同时间点EIAVFDDV免疫马匹外周血中EIAVgp90基因的序列,可对多克隆构成的EIAVFDDV在免疫马匹体内的进化动态做如下描述:免疫后15天,EIAVFDDV的部分毒株可以克服宿主的天然免疫压力对宿主进行感染。2-4个月时,疫苗弱毒株在宿主体内以趋于单一的、且可能相对于亲本强毒珠出现回复突变的准种形式存在。免疫后4-6个月时,趋于单一的、且基因构成与EIAVFDDV较为相近的病毒种群,将替代2-4个月时发生突变的病毒种群作为免疫成熟时的准种,相对稳定地存在于宿主血浆中。同时,血浆病毒载量监测结果表明,免疫成熟过程中,外周血游离病毒粒子的RNA拷贝数在102-105拷贝/ml范围内的低拷贝水平波动。使用连续给予地塞米松的方法,对EIAVFDDV免疫成熟马匹进行了免疫功能抑制,并对比监测了免疫抑制前后马匹血浆中疫苗毒株的载量。监测结果表明,3匹免疫马在免疫功能受抑制后,2匹血浆中EIAV载量中略有下降,而1匹略有上升,但载量水平均处于免疫马匹体内EIAVFDDV载量变化的正常范围。该实验结果提示,疫苗毒株的生物学特性,而非免疫压力是EIAVFDDV在宿主血浆中低拷贝存在的主要原因。而在免疫系统功能受抑制状态下,疫苗株在马体内仍维持稳定的低拷贝复制状态,支持了疫苗株EIAVFDDV应用中的安全性。使用EIAVFDDV与基于EIAVFDDV单一毒株基因背景构建和拯救出的疫苗感染性克隆毒EIAVFDDV3-8,分别免疫马匹,并在免疫成熟后进行攻毒。攻毒实验结果表明,多克隆构成的EIAVFDDV诱导的免疫保护明显优于构成相对单一的感染性克隆毒EIAVFDDV3-8。同时中和实验提示,能够诱导明显优于EIAVFDDV3-8的高水平中和抗体,可能是EIAVFDDV诱导良好免疫保护的主要原因。该实验结果支持EIAVFDDV的多克隆构成特性,在其诱导免疫马匹产生良好免疫保护中起作用。本论文获得的研究结果,作为对EIAV疫苗弱毒株生物学特性评价的基础数据,不仅可以帮助我们更多的了解疫苗弱毒株的生物学特性,而且对深入研究疫苗弱毒株诱导免疫保护的机制也十分必要。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 国外 EIAV 的研究进展
• 1.1.1 EIAV 基因结构和病毒蛋白功能研究
• 1.1.2 EIAV 与感染马间的相互作用
• 1.2 中国 EIA 弱毒疫苗及相关研究进展
• 1.2.1 中国EIA 弱毒疫苗研制的路线
• 1.2.2 中国EIA 弱毒疫苗致弱和诱导免疫保护机制的研究
• 1.3 将要开展的研究工作及本实验的目的与意义
• 第二章 EIAVFDDVgp90 基因的多克隆构成及体内复制动态
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 病毒和细胞
• 2.1.2 EIAVFDDV免疫马匹及实验样本的采集
• 2.1.3 马PBMC 的分离及前病毒DNA 的提取
• 2.1.4 病毒RNA 的制备和反转录
• 2.1.5 PCR 和nest PCR
• 2.1.6 Nest PCR 的敏感性实验
• 2.1.7 PCR 产物的克隆、测序和分析
• 2.1.8 Real time RT-PCR 标准曲线建立
• 2.1.9 免疫马体内病毒载量的定量分析
• 2.2 实验结果
• 2.2.1 Nest PCR 敏感性实验结果
• FDDV gp90 基因的多样性构成'>2.2.2 EIAV_FDDV gp90 基因的多样性构成
• FDDV gp90 基因在免疫马体内的进化动态'>2.2.3 EIAV_FDDV gp90 基因在免疫马体内的进化动态
• 2.2.4 Real time RT-PCR 标准曲线建立
• FDDV在免疫马体内的载量动态'>2.2.5 EIAV_FDDV在免疫马体内的载量动态
• 2.3 讨论
• FDDV免疫马体内 EIAV 载量的影响'>第三章 免疫抑制对 EIAV_FDDV免疫马体内 EIAV 载量的影响
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 实验动物、临床指标监测与样本采集
• 3.1.2 免疫抑制程序与抑制效果评价（淋巴细胞增殖实验和DTH 检测）
• 3.1.3 Nest PCR 和real time RT-PCR
• 3.2 实验结果
• 3.2.1 免疫抑制过程中的临床指标监测
• 3.2.2 DTH 实验结果
• 3.2.3 PHA-P 作为刺激原的非特异性淋巴细胞增殖实验结果
• 3.2.4 Nest PCR 检测和序列分析结果
• 3.2.5 Real time RT-PCR 的检测结果
• 3.3 讨论
• FDDV与感染性克隆毒 EIAV_FDDV3-8 诱导免疫保护的差异比较'>第四章 EIAV_FDDV与感染性克隆毒 EIAV_FDDV3-8 诱导免疫保护的差异比较
• 4.1 材料方法
• 4.1.1 实验动物和细胞
• 4.1.2 病毒
• 4.1.3 攻毒实验
• 4.1.4 反转录酶活性检测
• 4.1.5 Nest PCR 和real time RT-RCR
• 4.1.6 中和实验（中和实验、MTT 染色和巨噬细胞生长状态的显微镜观察）
• 4.2 实验结果
• 4.2.1 攻毒后实验马匹的临床体征和病毒载量
• 4.2.2 中和抗体水平检测
• 4.2.3 攻毒后未出现EIA 临床症状免疫马体内病毒gp90 基因序列的扩增与分析
• 4.3 讨论
• 第五章 全文结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历