产碱性蛋白酶菌株Bacillus pumilus Zk202的选育与酶学性质研究

论文摘要

碱性蛋白酶在食品、洗涤及制革等行业中有着广泛的用途。本论文从盐碱地土壤中分离筛选出一株产碱性蛋白酶的野生菌株Zk202,并进行了菌株的鉴定、诱变提高酶活、发酵条件优化、粗酶的提纯和酶学性质的初步研究。研究结果如下:1.从盐碱地土样中分离到一株耐盐耐碱的芽孢杆菌,其可在NaCl浓度为5%～10%的培养基中生长良好,耐碱性达到pH值为13,经形态学观察、生理生化特征研究及16S rDNA序列比对,结果表明该菌属芽孢杆菌属（Bacillus sp.）中短小芽孢杆菌的新的亚种,命名为耐盐碱短小芽孢杆菌Zk202。2.通过紫外线诱变和化学诱变进行复合诱变,结果表明紫外线照射80 sec,DES浓度为2%、处理时间为40 min,菌株产蛋白酶效果最佳。44 h的发酵液酶活力由81 U/ml提高至321 U/ml。3.通过单因子试验和正交试验,在摇瓶培养条件下对菌株的碳源、氮源、金属离子、培养温度、接种量等产酶条件进行了优化。得到了菌株的最适产酶条件为:培养基初始pH 9.0,葡萄糖浓度为1.5%,蛋白胨浓度为1.5%,钙离子浓度为0.01%,接种量2%,培养温度为36℃,发酵时间为45 h。在此条件下,碱性蛋白酶的酶活力可达383 U/ml。4.粗酶液通过硫酸铵盐析沉淀、透析除盐、凝胶柱层析等步骤,对碱性蛋白酶进行了纯化,纯化后的样品经SDS-PAGE得单一酶带。其比活力达到了954 U/mg,纯化了6.13倍,酶活力回收率为27.6 %。5.通过SDS-PAGE对酶的分子量进行了测定,测得该酶分子量为25000 Da。当以酪蛋白为底物时,其最适作用pH为11,最适作用温度为50℃。

论文目录

• 摘要
• SUMMARY
• 文献综述
• 1 前言
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 样品及菌株来源
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 仪器
• 2.1.4 试剂
• 2.2 方法
• 2.2.1 产碱性蛋白酶菌株的筛选与分离纯化
• 2.2.2 菌株的鉴定
• 2.2.3 产碱性蛋白酶菌株的诱变
• 2.2.4 产碱性蛋白酶菌株的发酵条件研究
• 2.2.5 碱性蛋白酶纯化工艺与酶学性质初步研究
• 2.3 结果统计
• 3 结果与分析
• 3.1 酶活力测定标准曲线
• 3.2 产蛋白酶菌株的筛选结果
• 3.3 菌株的鉴定
• 3.3.1 菌落形态及生理生化特性
• 3.3.2 16S rDNA 序列分析
• 3.4 产碱性蛋白酶菌株的诱变结果
• 3.4.1 紫外线及硫酸二乙酯（DES）对菌株Zk202 诱变处理时间的确定
• 3.4.2 紫外线照射和DES 处理复合诱变结果
• 3.5 产碱性蛋白酶菌株的发酵条件研究结果
• 3.5.1 培养条件对菌株生长和产酶的影响
• 3.5.2 培养基组成对菌株产酶的影响
• 3.5.3 培养基组成正交试验
• 3.6 确证试验
• 3.7 碱性蛋白酶的分离纯化及酶学性质初步研究
• 3.7.1 Lowery 法标准曲线
• 3.7.2 碱性蛋白酶的纯化
• 3.8 酶性质初步研究
• 3.8.1 酶的分子量测定
• 3.8.2 酶的最适作用pH
• 3.8.3 酶的最适作用温度
• 3.8.4 蛋白酶的热稳定性
• 3.8.5 蛋白酶的pH 稳定性
• 4 讨论
• 4.1 菌株形态﹑培养及生化特点
• 4.2 复合诱变的效果
• 4.3 碳源与氮源对产酶的影响
• 4.4 产酶历程与菌体生长
• 4.5 碱性蛋白酶的分离纯化与酶的基本性质
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 个人简介
• 导师简介