甘蓝型油菜苯丙氨酸解氨酶及其抑制因子的研究

论文摘要

油菜是世界四大油料作物之一，也是我国最为重要的油料作物之一，在我国农业生产中占有重要地位。甘蓝型黄籽油菜近年来颇受研究人员重视，它与相同遗传背景下的黑籽油菜相比有着许多优良性状：种子含油量高且油质好、种子种皮薄、没有色素积累或色素积累很少、菜籽饼粕蛋白质含量高、粗纤维和酚类化合物含量低等。从甘蓝型黄籽油菜初次选育到现在经历了几十年的时间，然而黄籽性状遗传不稳定这一难题至今仍未得到明确的阐述，它一直阻碍着甘蓝型黄籽油菜的育种进程。 苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia-lyase，PAL，EC4.3.1.5），主要催化L-苯丙氨酸脱氨生成反式肉桂酸，为多种酚类及类黄酮终产物提供前体物质，是连接初级代谢和苯丙烷类代谢、催化苯丙烷类代谢第一步反应的酶，是苯丙烷类代谢的关键酶和限速酶。通过此途径可以产生多种具有重要生理功能的次生物质如花色素、花色苷、木质素、植保素等，这些物质在植物的生长发育、抗病、抗逆反应中起着重要的作用。已有研究表明甘蓝型油菜黄、黑籽的色泽差异与PAL活性有关，PAL可能是黄籽种皮呈色的关键因素。研究油菜PAL及其抑制因子可以进一步研究PAL在种皮呈色中的作用机理，也可以为研究甘蓝型油菜黄籽形成机理提供基础，还可以为常规育种或生物技术育种创造稳定的甘蓝型黄籽油菜提供基础。本研究对甘蓝型油菜PAL的分离纯化、基本性质及其抑制因子等进行了研究和探索，主要研究结果如下： 1．通过比较筛选发现，0.1mol／L的硼酸缓冲液较适合甘蓝型油菜PAL的提取，40℃的保温温度较适合其活性的检测。通过对各个部位PAL活性的比较发现，开花后35d的甘蓝型黑籽油菜荚果活性最高，是作为分离纯化PAL的最佳材料。另外，通过用DEAE FF和Q FF两种离子交换柱来纯化脱盐后的PAL比较发现，Q FF柱更适合用于甘蓝型油菜PAL的分离纯化。 2．为了研究不同饱和度的硫酸铵溶液制备PAL的效果，对PAL粗提液进行了分级盐析，结果表明甘蓝型油菜PAL主要集中在35％～60％饱和度的硫酸铵盐析范围内沉淀出来。采用硫酸铵盐析沉淀、透析袋脱盐、HiPrep16／10 Q FF阴离子交换柱层析分离对甘蓝型油菜PAL

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 甘蓝型黄籽油菜简介
• 1.2 甘蓝型黄籽油菜研究进展
• 1.2.1 种皮色泽的遗传学研究
• 1.2.2 种皮结构的研究
• 1.2.3 种皮色素种类及含量的研究
• 1.2.4 种皮色素形成过程中可能涉及到的一些酶类的研究
• 1.3 PAL的研究进展
• 1.3.1 PAL的存在与分布
• 1.3.2 PAL的酶学性质
• 1.3.3 PAL对植物生理代谢的意义
• 1.3.4 PAL的调控方式
• 1.3.5 PAL的研究展望
• 1.4 植物酶的分离纯化
• 第二章 引言
• 2.1 立论依据
• 2.2 技术路线
• 第三章 材料与方法
• 3.1 材料
• 3.2 材料准备
• 3.3 主要试剂及仪器设备
• 3.3.1 主要试剂
• 3.3.2 主要仪器设备
• 3.4 实验方法
• 3.4.1 PAL活性测定及活性单位定义
• 3.4.2 蛋白质含量的测定
• 3.4.3 纯化前的准备
• 3.4.4 PAL的部分分离纯化
• 3.4.5 PAL的基本性质
• 3.4.6 甘蓝型油菜荚果 PAL抑制因子的研究
• 第四章 结果与分析
• 4.1 分离纯化条件的优化
• 4.1.1 提取、检测体系的优化
• 4.1.2 纯化材料的筛选
• 4.1.3 盐析条件的优化
• 4.1.4 离子交换柱的筛选
• 4.2 甘蓝型油菜荚果 PAL的分离纯化
• 4.2.1 HiPrep16/10 Q FF阴离子交换柱层析结果
• 4.2.2 甘蓝型油菜荚果 PAL的分离纯化
• 4.3 甘蓝型油菜英果PAL的基本性质研究
• 4.3.1 甘蓝型油菜英果 PAL最适pH及pH耐受性研究
• 4.3.2 甘蓝型油菜荚果 PAL最适温度及温度耐受性研究
• 4.3.3 甘蓝型油菜英果 PAL最适底物浓度研究
• 4.3.4 动力学曲线与米氏常数（Km）的测定
• 4.3.5 甘蓝型油菜荚果 PAL贮存性质研究
• 4.4 甘蓝型油菜荚果 PAL抑制因子的研究
• 4.4.1 甘蓝型油菜荚果 PAL-I的初步研究
• 4.4.2 巯基化学修饰剂（NEM）的抑制作用
• 4.4.3 末端产物对酶活性的抑制作用
• 4.4.4 金属离子对 PAL酶活性的影响
• 第五章 讨论
• 5.1 关于酶的分离纯化
• 5.2 关于酶的基本性质
• 5.3 关于酶的抑制因子
• 第六章 结论
• 参考文献
• 缩略词
• 致谢
• 发表论文及参与课题一览表