论文摘要
目的由于缺血坏死而导致心肌细胞的减少是急性心肌梗塞及心脏衰竭的一个共同特征。对缺血性心肌损伤的治疗主要集中于改善心肌的血供,减轻心肌缺血的症状,却不能使心肌细胞再生,从而不能避免心衰的发生。因此,采用细胞移植代替不可逆性心肌细胞的丢失有望成为受损心肌修复的另一种有效途径。目前,用于心肌细胞替代治疗的移植细胞种类较多,包括骨骼肌卫星细胞,胚胎性干细胞和成体干细胞,胎儿心肌细胞等。骨骼肌卫星细胞所具有的易于获得、用自体骨骼肌卫星细胞移植无需免疫抑制、细胞在培养阶段易于接受外源基因、不受伦理限制等优点而成为心梗区细胞移植研究的热点。移植细胞要发挥功能必须与周围正常心肌细胞在解剖结构上发生整合以达到同步收缩。缝隙连接（gap junction）,又称间隙连接、通讯连接,是由相邻两个细胞之间的连接蛋白排列而成的一种特殊膜结构。相邻细胞通过缝隙连接所介导的细胞间通讯（ gap junction intercellular communication,GJIC）进行着信息、能量和物质的交换,参与细胞间物质交换的代谢偶联和电信号传递的电偶联,这对细胞的新陈代谢、内环境稳定、增殖和分化等生理过程起着重要的调控作用。在心肌中connexin43为主要的连接蛋白,心肌细胞之间的电信号传导有赖于缝隙连接蛋白结构和功能的完整,因此连接蛋白表达对于实现同时收缩意义重大。目前,有文献报道移植的原代骨骼肌卫星细胞因不能同宿主细胞形成良好的电偶联而导致实验动物心率失常。本研究通过将携带有connexin43cDNA的真核表达载体,以lipofectamine2000为转染试剂转染大鼠骨骼肌卫星细胞,并通过免疫细胞化学技术、激光共聚焦扫描技术、western-blot技术等观察缝隙连接蛋白connexin43在大鼠骨骼肌卫星细胞中的表达的情况,并从中选取connexin43蛋白表达高的细胞。该细胞可用于进行移植细胞之间及移植细胞与宿主细胞之间能否形成良好的电偶联的研究。方法1将携带connexin43cDNA的真核表达载体Bill-neo导入DH-5α大肠杆菌中扩增,再提取、纯化及鉴定质粒。将携带connexin43cDNA的真核表达载体Bill-neo导入大肠杆菌DH-5α菌株,用含氨苄青霉素的LB平板选择阳性菌落。按天根小提质粒试剂盒和Wizard? Purefection Plasmid DNA Purification System操作说明进行质粒的提取纯化,最后进行酶切鉴定。2大鼠L6骨骼肌卫星细胞培养复苏大鼠L6骨骼肌卫星细胞后,在37℃,5%CO2条件下,用DMEM完全培养基（含15%胎牛血清,青霉素100U/ml,链霉素100U/ml）培养,每48小时换液。为保持其理想未分化状态,当细胞达到60%70%融合时,即进行传代。3转染connexin43基因的大鼠L6骨骼肌卫星细胞的G418筛选浓度的确定将大鼠L6骨骼肌卫星细胞以5×105的密度种植与6孔培养板中,于完全培养基中分别加G418使其终浓度分别为100mg/ml,200mg/ml,250mg/ml,400mg/ml,600mg/ml,各浓度3复孔,正常对照3复孔（即不加筛选抗生素）培养14天后观察细胞死亡情况,选择高于杀死全部细胞药物浓度一个梯度的浓度为筛选浓度。4脂质体体外转染骨骼肌卫星细胞,确定最适转染条件及阳性单克隆细胞的获得大鼠L6骨骼肌卫星细胞以5×105,密度接种在35mm培养皿中培养,24小时后达70%融合。将lipofectamine2000同EGFP-N1按不同比例混合,其余操作按lipofectamine2000转染试剂说明进行基因转染,确定最适转染比例。再将脂质体与携带connexin43cDNA的真核表达载体Bill-neo按最适比例混合,进行转染。转染24小时后加入G418（400mg/ml）筛选。14天后挑取具有G418抗性的阳性单克隆细胞分别扩大培养（以下称阳性单克隆细胞）。5免疫细胞化学法和Western-blot法检测阳性单克隆细胞中connexin43蛋白表达的结果5. 1免疫细胞化学法检测阳性单克隆细胞中connexin43蛋白表达取转染connexin43基因和转染空载体贴壁生长的细胞分别爬片,用4%的多聚甲醛固定,行免疫细胞化学染色,检测细胞中connexin43蛋白的表达情况,并由图象分析软件分别计算出随机视野中阳性细胞的光密度值;统计方法选用单因素方差分析法。5. 2 western-blot法检测阳性单克隆细胞中connexin43蛋白表达提取细胞总蛋白,用考马斯亮蓝进行蛋白定量,制备不连续SDS-聚丙烯酰胺凝胶（4%浓缩胶和10%分离胶）。取各组变性胞浆蛋白上样于凝胶加样孔内,进行恒压电泳。用水浴式电转移装置将凝胶上的蛋白质转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上,将膜置于5﹪脱脂奶粉封闭,加兔抗大鼠connexin43蛋白多克隆抗体,4℃孵育过夜。加入HRP标记的羊抗兔IgG二抗,37℃孵育1h。采用化学发光法观察结果。用Scion-Image软件对结果进行半定量分析,统计方法选用单因素方差分析法。结果1携带connexin43cDNA真核表达载体Bill-neo的酶切结果及质粒纯度、浓度结果酶切电泳结果显示前方的细条带大小约1.7kb,与connexin43基因的cDNA大小相符,后方的较粗条带大小约6.9kb,与载体大小相符。扩增质粒的浓度:OD260×50×50=150mg/ml400mg/ml扩增质粒的纯度:OD260/OD280=1.821.86结果显示质粒浓度较高,纯度较好,可用与细胞体外转染2大鼠L6骨骼肌卫星细胞培养贴壁生长的大鼠L6骨骼肌卫星细胞呈梭形,当细胞相互接触后会发生细胞融合,形成肌管。3转染connexin43基因的大鼠L6骨骼肌卫星细胞的G418筛选浓度G418的筛选浓度为400mg/ml。4携带connexin43cDNA的真核表达载体Bill-neo转染大鼠L6骨骼肌卫星细胞的最适转染条件及阳性单克隆细胞的获得4.1携带connexin43cDNA的真核表达载体Bill-neo转染大鼠L6骨骼肌卫星细胞的最适转染条件结果显示脂质体与质粒比例为1∶1时发荧光的细胞最多,表明质粒被转染进入大鼠L6骨骼肌卫星细胞并获得表达。故本实验脂质体与质粒最适比例确定为1:1。最高转染效率可达40%。4.2大鼠L6骨骼肌卫星细胞转染connexin43cDNA后阳性单克隆细胞的获得转染后的大鼠L6骨骼肌卫星细胞呈圆形,加入G418 400mg/ml进行筛选,细胞死亡明显,14天后筛选出少量阳性单克隆细胞。对照组细胞经G418在相同浓度下筛选14天后全部死亡。5免疫细胞化学和Western-blot法检测阳性单克隆细胞中connexin43蛋白表达的结果5.1免疫细胞化学法检测阳性单克隆细胞中connexin43蛋白表达的结果阳性克隆组:细胞呈梭形,略圆钝。胞浆中出现了棕黄色的颗粒状物质,分布不均;染空载体组:细胞呈梭形。胞浆中未见明显的棕黄色的颗粒状物质。通过图像分析软件检测组间阳性细胞的平均光密度,发现阳性克隆组connexin43蛋白表达明显高于转染空载体组。5.2 western-blot法检测阳性单克隆细胞中connexin43蛋白表达的结果将显色条带扫描至计算机中,用Scion-Image软件对结果进行半定量分析,用任意单位AU（Darea?Ddensity）表示凝胶谱带的面积×荧光强度值,发现发现阳性单克隆组connexin43蛋白表达明显高于空载体组,两组有显著差异。（转染空载体组为0.89±0.101阳性单克隆1组为2.138±0.098阳性单克隆2组为2.236±0.168,P<0.05,）结论1采用脂质体体外转染法,建立了高表达connexin43蛋白的大鼠L6骨骼肌卫星细胞/cx43细胞系,其connexin43蛋白表达较亲代大鼠L6骨骼肌卫星细胞明显增高。该细胞系可用于进行移植细胞之间及移植细胞与宿主细胞之间能否形成良好的电偶联的进一步研究。2针对本实验的特点,优化了大鼠L6骨骼肌卫星细胞的转染条件,从而获得了高表达connexin43蛋白的细胞系。3本实验结果证明,阳离子脂质体能介导外源性connexin43基因进入真核细胞。并且,阳离子脂质体介导方法确有转染效率高、使用简单快捷的优点,它应该成为今后细胞基因治疗中可以使用的方法。