免疫质谱检测肝癌患者血清多肽标志物的方法与应用研究

论文摘要

在蛋白质组学研究的很长时间内,天然多肽被视为体内代谢的生物垃圾。最近几年很多研究者发现,多肽作为蛋白代谢产物,反映了体内生物代谢过程。多肽组是疾病标志物的重要的宝库,对于肿瘤的早期预警、早期诊断具有重要的研究意义。肝癌作为世界范围内高发病率疾病,引起众多研究者的关注,其在亚洲,具有与乙肝、肝硬化等密切联系的疾病特点,因此肝癌的早期预警技术研究对于预防肝癌、预测肝癌的发病趋势具有特殊的研究价值和社会意义。目前,用于临床确诊的肝癌标志物主要还是甲胎蛋白（Alpha-fetoprotein,AFP）、鳞状细胞癌抗原免疫球蛋白M复合物（SCCA-IgM IC）、α-L-岩藻糖苷酶（AFU）及其他联检标志物,最常用的AFP诊断方法对于直径3cm以下的肿瘤具有诊断局限性。因此急需开展新的标志物的研究,以适应肝癌的早期诊断研究。本论文建立了一种免疫质谱检测多肽标志物的方法,同时将该方法应用于肝癌患者血清多肽的检测分析。首先我们采用传统的单克隆抗体制备方法制备出2种多肽单克隆抗体:抗SP0104抗体、抗SP0105抗体,在此基础上使用Protein G Agarose建立了基于多肽抗体和MALDI-TOF-MS的免疫质谱方法,使用该方法对两种多肽标准品SP0104、SP0105进行检测,偏差小于0.5Da。本文进一步优化了影响免疫质谱方法灵敏度和通量的条件,确定优化结果抗体/载体量比为3.9μg/μL,抗体与载体联接采用非交联方式、抗体孵育环境4℃旋转、抗体孵育时间15分钟、抗原孵育时间8小时、洗脱液含0.1%TFA的70%ACN、洗脱时间1分钟。通过优化以上影响抗体固定和抗原检测的关键因素,提高了免疫质谱方法检测通量及灵敏度。本文分别对所建立优化后的免疫质谱方法的线性范围、准确性、重复性、冻融稳定性进行方法评价,其中在0.1pmol6.4pmol范围内线性关系良好,检测限0.1pmol,线性方程为I=601.5N-79.3,相关系数为0.9642。我们分别将0.3pmol、0.9 pmol、2.7pmol标准品注入空白血清,回收率为117.6%、81.6%、125%,平行检测三次,RSD分别为26.3%、5.4%、25.6%。将0.9 pmol标准品注入空白血清,经三次冻融偏差幅度为7.3%19.2%,显示3次冻融检测结果具有稳定性。评价结果表明,优化后的免疫质谱方法适用于血清低浓度多肽的检测。最后我们比较了有机溶剂沉淀、超滤、去除IgG和白蛋白、解离白蛋白连接的多肽等4种血清多肽预处理方法和不处理对免疫质谱检测结果的影响,结果表明不处理时标志物检测值最高。采用通过优化的免疫质谱方法完成对20例正常血清、20例肝癌血清的检测,结果两组质谱峰强度检测值经过t检验,P<0.003,两组检测值具有显著性差异。结果表明免疫质谱方法可用于肝癌多肽血清标志物的诊断研究。

论文目录

• 缩略词表
• 摘要
• Abstract
• 前言
• 1.1 研究意义
• 1.2 研究现状
• 1.3 本论文研究目的、研究思路、研究策略与研究流程
• 1.4 本论文的研究内容
• 第一章 免疫质谱方法的建立
• 1 材料与仪器
• 1.1 材料
• 1.2 仪器
• 2 实验方法
• 2.1 单克隆抗体制备
• 2.2 间接ELISA 检测
• 2.3 SDS-PAGE
• 2.4 银染方法
• 2.5 凝胶扫描
• 2.6 免疫亲和富集抗原
• 2.7 质谱检测
• 3 结果与讨论
• 3.1 多肽抗原的筛选与合成
• 3.2 多肽单克隆抗体的制备
• 3.2.1 尾血检测
• 3.2.2 阳性杂交瘤细胞的初筛和复筛
• 3.2.3 杂交瘤细胞抗体亚型鉴定
• 3.2.4 杂交瘤细胞上清抗体灵敏度
• 3.2.5 杂交瘤细胞保存
• 3.2.6 单抗腹水效价、纯化单抗滴度检测
• 3.3 免疫质谱方法建立和多肽标准品检测
• 4 本章小结
• 第二章 免疫质谱方法的优化
• 1 材料与仪器
• 1.1 材料
• 1.2 仪器
• 2 实验方法
• 2.1 SDS-PAGE
• 2.2 银染方法
• 2.3 凝胶扫描
• 2.4 免疫亲和富集抗原
• 2.5 质谱检测
• 3 结果与讨论
• 3.1 免疫亲和平台制备条件优化
• 3.1.1 抗体/载体量比
• 3.1.2 抗体联接方式
• 3.1.3 抗体孵育环境
• 3.1.4 抗体孵育时间
• 3.2 抗原检测条件优化
• 3.2.1 抗原孵育时间
• 3.2.2 洗脱缓冲液
• 3.2.3 洗脱时间
• 4 本章小结
• 第三章 免疫质谱方法的评价
• 1 材料与仪器
• 1.1 材料
• 1.2 仪器
• 2 实验方法
• 2.1 免疫亲和富集抗原
• 2.2 质谱检测
• 3 结果与讨论
• 3.1 线性范围、相关系数和检测限
• 3.2 准确性和重复性
• 3.3 冻融稳定性
• 4 本章小结
• 第四章 免疫质谱方法在肝癌血清诊断中的应用
• 1 材料与仪器
• 1.1 材料
• 1.2 仪器
• 2 实验方法
• 2.1 样本收集和保存
• 2.2 血清预处理
• 2.2.1 有机溶剂沉淀
• 2.2.2 超滤
• 2.2.3 去除IgG 和白蛋白
• 2.2.4 解离白蛋白联接的多肽
• 2.3 免疫亲和富集抗原
• 2.4 质谱分析
• 2.5 数据库检索
• 3 结果与讨论
• 3.1 临床血清预处理优化
• 3.2 临床血清检测
• 4 本章小结
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 综述
• 参考文献
• 个人简历
• 攻读硕士学位期间发表文章与研究成果
• 致谢