杀菌/通透性增加蛋白（BPI）mRNA表达水平的初步研究及人BPI活性片段基因的克隆

论文摘要

杀菌／通透性增加蛋白（Bactericidal／permeability-increasing protein，BPI）是哺乳动物中性粒细胞中存在的一种碱性蛋白，它能与革兰氏阴性菌脂多糖结合，增加外膜对抗菌药物的通透性，具有中和内毒素和杀灭细菌的生物学作用，在革兰氏阴性菌感染的治疗方面有良好的发展前景。本研究分为两部分：第一部分采用巢式RT-PCR技术，对22例慢性支气管炎患者入院时及使用阿奇霉素氯化钠注射液7天后的外周血中BPImRNA含量进行半定量检测，考察感染患者使用阿奇霉素后对BPImRNA表达水平的影响，分析BPI在炎症过程中的动态变化。第二部分从人外周血多形核白细胞中提取总RNA，经RT-PCR扩增出编码BPIN端活性部位199个氨基酸的基因片段(BPI597)，并将其克隆入pBS-T载体，为下一步的研究奠定基础。第一部分：杀菌／通透性增加蛋白（BPI）mRNA表达水平的研究方法：选取22例慢性支气管炎患者为实验组，18例健康体检者为对照组，选择病原菌均为肺炎球菌的患者进行实验，对患者应用阿奇霉素治疗。对照组性别、年龄均与实验组相匹配。健康体检者及感染患者分别于入院当天和治疗7±2天后采集EDTA-K2抗凝血6ml。其中1ml用于血常规检测，5ml用于提取总RNA。逆转录为cDNA后进行巢式PCR扩增反应扩增出BPIcDNA特异性片段。扩增产物电泳后半定量分析：目标基因光密度值与内参光密度值的比值代表外周血中BPImRNA表达量的相对多少。数据以x±s表示，结果应用SPSS10.0统计软件分析，采用t检验进行均数比较，检验水准为α=0.05。结果1．总RNA提取产物的鉴定对照组及实验组总RNA的OD260nm／OD280nm比值，结果均大于1.8，表明所提总RNA具有较高的纯度。提取的对照组及实验组总RNA经1％琼脂糖凝胶电泳，可见明显的28s，18s和5s条带，表明所提取的总RNA有较好的完整性，符合逆转录要求。2 BPImRNA目的基因片段RT-PCR结果取各组扩增产物于2％琼脂糖凝胶中80V电泳45min，紫外下观察可见：400bp附近处条带为BPImRNA基因片段，300bp附近处条带为内参β-actin基因片段。3 BPImRNA表达水平的结果及统计学分析18例健康受试者外周血中BPImRNA的平均相对表达水平为0.74±0.40；22例慢性支气管炎患者入院时以及治疗后，外周血中BPImRNA的平均相对表达水平分别为0.46±0.23和0.24±0.19。通过两样本间t检验以及配对t检验，差异均有统计学意义。结论：实验结果表明，慢性支气管炎患者外周血中BPImRNA的平均相对表达水平明显低于正常健康对照组，且其使用阿奇霉素氯化钠注射液治疗后，表达水平更低。说明随着抗生素的广泛应用，BPI控制感染的能力逐渐降低，BPI质量或数量上缺失的病人容易遭受微生物或感染的入侵。第二部分：人BPI活性片段基因的克隆方法：EDTA-K2抗凝管采集健康人外周血5ml，分离多形核白细胞并用生理盐水稀释至5×107个／ml，-70℃保存用于提取总RNA。Trizol法抽提全血总RNA，逆转录后进行RT-PCR扩增获得目的基因，琼脂糖凝胶电泳后用Qiagen胶回收试剂盒回收PCR扩增产物。PCR扩增产物与pBS-T克隆载体进行连接反应。将连接体转化入JM109感受态细菌中，重组分子随受体菌的生长繁殖复制扩增。挑选白色菌落扩大培养后，从阳性克隆菌中提取质粒DNA，测序。结果：1．RT-PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳显示，在分子量约600bp处呈现1条与预期产物分子量（597bp）大小相符的DNA条带。2．连接物测序结果经比对，与目的序列一致。结论：BPI克隆载体构建成功，pBS-BPI597重组克隆质粒的获得，为下一步对BPI功能的研究工作奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 论文部分
• 杀菌/通透性增加蛋白（BPI）mRNA表达水平的初步研究及人BPI活性片段基因的克隆
• 前言
• 第一部分 杀菌/通透性增加蛋白（BPI）mRNA表达水平的初步研究
• 1 实验材料
• 2 实验方法
• 3 实验结果
• 4 讨论
• 5 小结
• 第二部分 人BPI活性片段基因的克隆
• 1 实验材料
• 2 实验方法
• 3 实验结果
• 4 讨论
• 5 小结
• 参考文献
• 综述部分
• 杀菌/通透性增加蛋白（BPI）的研究进展
• 参考文献
• 致谢