论文摘要
骨折是临床常见疾病,常需外科内固定手术处理以恢复骨的连续性和完整性。因此,内固定材料成为常用的医疗物质之一。内固定材料主要分金属生物内固定材料和非金属生物内固定材料。医用金属材料是一类生物惰性材料,除具有较高的机械强度、抗疲劳性能外,还具有一定的抗生理腐蚀性、无毒性和简易可行以及确切的手术操作技术。因此,金属材料成为目前临床内固定材料中应用最广泛的材料。然而,由于金属材料的高强度固定常常导致应力遮挡,骨折新生骨痂生长缓慢,皮质变薄;另外,金属材料常常需二次取出,增加了患者的痛苦和经济负担,严重者甚至在二次取出时或取出后造成再次骨折。所以,目前国、内外许多学者都在研究新的生物内固定材料以替代和避免金属材料的应用缺陷。纳米羟基磷灰石（nano-hydroxyapatite,n-HA）是人及动物骨骼、牙齿的主要无机成分,因此具有良好的生物相容性和生物活性。n-HA在植入人体后能在短时间内与人体的软组织及硬组织形成紧密结合而成为广泛应用的植骨代用品。然而,n-HA作为烧结材料表现出的脆性及抗疲劳性能差等缺点,阻碍了其临床应用。因此,理论上可以具备良好生物活性,又具备良好力学性能及降解性能的n-HA复合材料逐渐成为目前研究的热点。聚氨基酸（poly-amino acid, PAA）是由一种或者多种氨基酸聚合而成的一类在一次结构上以肽键为重复单元的可降解线型高分子材料。由于PAA具有良好的降解性能和生物相容性,因此在医用修复材料领域具有广泛的应用潜力。但是,PAA的溶解性和可加工性能差,极大地限制了PAA的应用。为此,四川大学严永刚教授等在总结现有PAA和聚酰胺材料以及其他现有医用高分子的基础上,设计发明了一类新型多元PAA高分子材料。这类高分子由6-氨基己酸作为主链,将人体所含有的α-氨基酸作为共聚单元。其中,6-氨基己酸赋予聚合物良好的力学性能和可加工性能,而其它共聚天然氨基酸单体可调节聚合物材料物理化学性能如亲、疏水性能、降解速率、降解产物及pH值等。本实验拟利用原位聚合法制备新型的n-HA/PAA复合材料,在综合分析材料的表征、组成与结构、降解性能、力学性能、亲水性以及体内、外生物相容性的基础上,通过内固定实验动物骨折以评价其作为内固定材料的可行性,为将来可能的临床应用提供科学的实验依据。目的:利用原位聚合法制备一种新型的n-HA/PAA复合材料,综合分析该材料的组成、结构特征以及降解和力学性能等;评价该材料的体内、外生物安全性与相容性;通过制作实验动物股骨髁间骨折模型,以n-HA/PAA复合材料固定棒内固定骨折,评价n-HA/PAA复合材料作为内固定材料的可行性。为n-HA/PAA复合材料固定棒的临床应用提供科学的实验依据。方法:本实验共由四部分组成:1. n-HA/PAA复合材料的制备与性能研究:利用原位聚合法制备不同n-HA质量比的n-HA/PAA复合材料;利用燃烧测试及扫描电镜观察复合材料中无机成分n-HA的分布;红外光谱及X线衍射观察复合材料的组成与结构;力学实验检测复合材料的初始力学性能;模拟体液浸泡实验研究材料的降解性能及亲水性。2. n-HA/PAA复合材料体外细胞相容性研究,本实验由两部分实验组成。实验一、n-HA/PAA复合材料与L929细胞毒性检测:通过直接接触和浸提液接触法将n-HA/PAA材料与L929细胞共同培养后观察材料对L929细胞的形态学影响;MTT法检测L929细胞增值度;Annexin V-FITC/PI双标记流式细胞仪检测L929细胞凋亡。实验二:n-HA/PAA复合材料与MG63成骨样细胞体外相容性研究:通过n-HA/PAA材料与MG63细胞共同培养后利用倒置相差显微镜、扫描电镜、DAPI荧光染色观察材料周围及表面MG63细胞的形态变化;MTT法检测MG63细胞吸光度值变化;以IFCC推荐法测定MG63细胞碱性磷酸酶活力变化;酶联免疫法检测MG63细胞骨钙素含量;流式细胞仪检测MG63细胞周期及Annexin V-FITC/PI双标记流式细胞仪检测MG63细胞凋亡情况。3. n-HA/PAA复合材料体内组织相容性研究,本实验由两部分实验组成。实验一、n-HA/PAA复合材料肌肉内埋植实验:选择聚乙烯对照研究n-HA/PAA复合材料肌肉埋植实验。观察n-HA/PAA材料在肌肉埋植24周内其周围肌肉组织大体情况、HE组织切片、透射电镜观察n-HA/PAA材料对肌肉组织的影响,同时检测n-HA/PAA材料埋植后的失重率及X线衍射分析材料可能的降解方式。实验二、n-HA/PAA复合材料骨内埋植实验:选择聚乙烯对照研究n-HA/PAA复合材料胫骨埋植实验。观察材料在胫骨埋植24周内其周围骨组织大体情况、硬组织切片观察材料对骨组织的影响、扫描电镜观察材料-骨界面结合情况,同时通过对比检测实验动物骨内植入前后血常规以及生化指标评价材料对全身的安全性影响。4. n-HA/PAA固定棒固定股骨髁间骨折的实验研究:制作新西兰大白兔股骨髁间骨折模型,使用n-HA/PAA复合材料固定棒及克氏针对照固定骨折。影像学观察骨折愈合情况;硬组织切片观察材料与骨界面的结合;力学推出实验检测材料与骨界面的结合力。结果:1. n-HA/PAA复合材料的制备与性能研究:原位聚合法可以成功制备n-HA/PAA复合材料。该材料经燃烧实验及扫描电镜观察结果表明n-HA在复合材料中分布均匀,n-HA/PAA复合材料均一性好;红外光谱及X线衍射分析结果表明n-HA与PAA之间由化学键结合,而非机械结合方式;体外初始力学测试表明含10wt%、20wt%、30wt%、40wt% n-HA的复合材料的压缩强度分别为140.65±10.26Mpa、128.44±9.92Mpa、117.74±9.21Mpa、62.41±6.25Mpa;弯曲强度分别为125.46±9.96Mpa、105.34±8.75Mpa、92.16±8.59Mpa、52.23±5.31Mpa;剪切强度分别为70.15±6.21Mpa、60.61±5.36Mpa、52.89±5.63Mpa、22.11±4.21Mpa,弯曲模量分别为15.69±2.68Gpa、12.18±2.03Gpa、9.16±1.88Gpa、5.01±0.82Gpa;模拟体液浸泡实验提示n-HA/PAA复合材料具有降解性,10%～40%n-HA质量比的复合材料12W失重率分别为6.97±0.63%、8.16±0.81%、17.98±1.69%、32.16±2.11% ;弯曲强度随降解而下降,至12W时分别为102.39±8.21Mpa、90.1±7.89Mpa、75.59±7.66Mpa、25.63±3.69Mpa; 30wt%及40wt%质量比n-HA复合材料具有良好的稳定的亲水性,各时间点亲水率可分别达10%和15%左右。2. n-HA/PAA复合材料体外细胞相容性研究实验一、n-HA/PAA复合材料与L929细胞毒性检测研究:体外细胞毒性实验观察n-HA/PAA复合材料对L929细胞形态及生长无明显影响,MTT检测实验组细胞毒性为1级,流式细胞仪检测n-HA/PAA复合材料不会引起细胞凋亡。实验二:n-HA/PAA复合材料与MG63成骨样细胞体外相容性研究:n-HA/PAA复合材料对MG63细胞形态无明显影响,材料周围及表面MG63细胞贴壁生长良好,并随时间增加而细胞数逐渐增多。MTT检测MG63细胞吸光度值随培养时间逐渐增加,细胞增殖明显,两组间各时间点比较无明显差异（P>0.05）。MG63细胞ALP活力及骨钙素含量随培养时间逐渐增加,两组比较无明显差异（P>0.05）。各组材料对MG63细胞的生长周期及凋亡无明显影响,且各时间点MG63细胞周期及凋亡细胞比较无明显差异（P>0.05）。3. n-HA/PAA复合材料体内组织相容性研究。实验一、n-HA/PAA复合材料肌肉内埋植实验:埋植期内,n-HA/PAA复合材料与聚乙烯对照组结果类似。n-HA/PAA复合材料不会引起周围肌肉组织异常炎症反应、免疫反应及异物排斥反应。体内埋植24Wn-HA/PAA复合材料失重率为10%左右;X线分析结果表明复合材料为表面腐蚀降解。实验二、n-HA/PAA复合材料骨内埋植实验:埋植期内,n-HA/PAA复合材料与聚乙烯同样不会引起周围骨组织异常炎症反应、免疫反应及骨溶解破坏或骨髓炎;扫描电镜提示复合材料植入后逐渐与骨组织结合紧密,表面被新生骨组织覆盖;且n-HA/PAA复合材料对实验动物肝、肾脏及血常规、生化指标无明显影响。4. n-HA/PAA固定棒固定股骨髁间骨折的实验研究:与克氏针对照组比较,n-HA/PAA固定棒具有同样的骨折内固定效应。硬组织切片提示实验组材料-骨界面结合更好,推出力学实验提示固定骨折早期两组比较无明显差别（P>0.05）,而4周及以后实验组与骨的结合力明显优于克氏针对照组（P<0.05）。结论:1.原位聚合法可以成功制备n-HA/PAA复合材料。n-HA与PAA通过化学键紧密结合,该复合材料具有良好的亲水性、力学性能与降解性能。2. n-HA/PAA复合材料对L929细胞无明显细胞毒性。3. n-HA/PAA复合材料与MG63细胞具有良好细胞相容性。4. n-HA/PAA复合材料体内埋植具有良好组织相容性;该材料在体内以表面腐蚀的方式降解。5. n-HA/PAA复合材料固定棒可有效固定实验动物股骨髁间骨折,有望为临床松质骨骨折内固定提供一种新的安全、有效而无需二次取出的新型生物内固定材料。
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