多巴胺受体DRD1 mRNA 3’ UTR在DRD1转录后水平表达调控中的作用

论文摘要

DRD1（dopamine receptor D1）是多巴胺受体的一种,是由七个跨膜区域（7-GM）组成的G蛋白偶联受体。DRD1广泛分布于神经系统,特别是尾壳核（Cpu）,伏隔核（Act）,视束（OT）,脑皮层（Cx）和杏仁核。DRD1通过正调控cAMP,激活蛋白激酶A,从而激活下游信号通路和细胞膜离子通道。研究表明DRD1在神经前体细胞的增殖与分化中发挥重要作用,另外DRD1受体的表达异常与药物成瘾,帕金森综合症等多种神经系统疾病有密切关系。HuD是ELAVL（embryonic lethal abnormal visual like）/Hu家族中的一员,在神经系统中特异表达。HuD通过其蛋白含有的三个RRM结构域识别和结合靶mRNA 3’UTR中的ARE元件,增加靶mRNA稳定性,引导靶mRNA胞内运输和调控靶mRNA翻译。HuD在神经突起的生长与修复,神经干细胞和神经前体细胞的细胞周期调控等方面发挥重要作用。HuD表达异常与多种神经系统疾病相关。ARE元件是一种重要的顺式作用元件,富含A和U,参与介导mRNA的降解。Tala等人在ARED3.0数据库中汇集了所有NCBI收录的mRNA 3’UTR上含有ARE元件的基因。通过检索ARED3.0数据库,我们发现DRD1 mRNA的3’UTR上具有一个进化保守的ARE元件。通过Real-time PCR实验,我们发现RA诱导后向神经元方向分化的P19细胞中DRD1和HuD呈同时上升的趋势,这提示我们HuD有可能识别DRD1 mRNA 3’UTR的ARE元件,并由此调控DRD1基因的表达。我们首先应用RNA-chip方法进行了检测。利用HuD抗体在P19细胞全蛋白裂解液中捕获HuD蛋白-RNA复合体,然后通过链霉亲和素珠从细胞全蛋白裂解液中分离纯化出抗体-HuD蛋白-RNA复合体。经过酚氯仿抽提出其中的RNA后,通过逆转录得到相应的cDNA,最后利用特异性引物通过PCR扩增出特异条带。发现在P19细胞中HuD蛋白结合DRD1 mRNA。随后通过REMSA实验,证实HuD蛋白识别并结合DRD1 mRNA 3’UTR上的ARE元件。说明HuD通过识别和结合DRD1mRNA 3’UTR上的ARE元件来实现对DRD1 mRNA的调控。通过荧光素酶报告实验,我们发现HuD蛋白能够上调DRD1基因的表达。将野生型DRD1 3’UTR序列插入报告质粒荧光素酶基因编码区下游,用报告基因重组质粒和HuD真核瞬时表达载体共同转染293ET细胞,我们发现与转染空质粒的对照组相比,带有野生型DRD1 3’UTR序列的荧光报告素酶活性有明显的上升。Real-time PCR实验表明过表达HuD蛋白后,含有野生型DRD13’UTR的荧光报告素酶转录本数量明显高于对照组。在P19细胞中过表达HuD蛋白后,Real-time PCR实验表明DRD1 mRNA也出现了上升。这说明HuD蛋白识别和结合靶基因mRNA 3’UTR的ARE元件后增加DRD1 mRNA的稳定性,从而促使靶基因表达上调。最后我们还发现HuD蛋白影响miR-504对DRD1的上调作用。受到W.Huang等在HEK293细胞中观察到has-miR-504可以上调人源DRD1表达的报道的提示,我们在293ET细胞中观察到过表达mmu-miR-504可以上调小鼠源DRDl的表达。我们将miR-504瞬时表达载体和带有DRD1 3’UTR的荧光报告素酶表达质粒共同转染293E T细胞,24小时后荧光报告素酶表达出现显著上升;而如果将HuD瞬时表达载体与前二者同时转染293ET细胞,24小时后荧光报告素酶的上调程度会受到明显抑制。这是第一次发现HuD对靶基因的调控涉及miRNA。综上所述,我们发现DRD1 3’UTR上的ARE元件能够被HuD蛋白识别和结合,从而增加DRD1 mRNA的稳定性,提高DRD1在细胞中的表达。另外,miR-504可能影响HuD蛋白对于DRD1的表达调控。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 实验材料与方法
• 实验结果
• 讨论
• 不足与展望
• 小结
• 参考文献
• 论文综述
• 附录
• 个人简历
• 致谢