银杏、油菜和荠菜脱水素基因的克隆和研究

论文摘要

脱水素是一类与胚胎发育和抗逆相关的蛋白质，含有至少一个可以形成a-螺旋的K-片段。在受到环境胁迫如干旱、低温、盐碱等而导致植物体细胞脱水时，脱水素的表达量也随之升高，这说明植物的抗逆与脱水素的表达量之间有一定的关系。转基因研究表明，异源表达脱水素基因可以提高植物的抗逆性，脱水素基因在植物抗逆基因工程中具有很大的应用潜力。本文对植物脱水素基因进行研究，以银杏、油菜和荠菜为材料，利用RACE-PCR技术，成功地从中克隆出了脱水素基因，并对其功能进行了研究。首次从银杏中克隆到一个新的脱水素基因GbDHN。银杏脱水素基因GbDHN全长cDNA为820bp，含有一个489bp的开放阅读框（ORF），编码一个有163个氨基酸残基脱水素蛋白；预测的等电点（pI）为5.75，分子量约为17kDa。GbDHN具有一个S-片段和一个K-片段，同源比对分析表明，这两个片段的保守性很高。Southern杂交表明GbDHN属于单拷贝的基因家族。RT-PCR用来进行GbDHN的表达图谱分析。结果表明GbDHN是组织特异性表达的基因，在根和茎中都有表达。在外源脱落酸，干旱和盐处理下，GbDHN的表达量都有所提高，这说明GbDHN的表达调控是通过依赖于脱落酸的信号传导途径，而且该基因在植物体受到环境胁迫而脱水时，可能起到维持植物体正常生长和发育的重要作用。利用基因组步移技术，克隆到银杏脱水素基因GbDHN的5’-侧翼区，并对其5’-侧翼区进行了生物信息学的分析，对启动子基本活性元件和脱落酸应答相关的元件进行了预测。启动子基本活性元件TATA-box位于转录起始位点前的-27bp处。GbDHN的5’-侧翼区具有两个脱落酸响应元件（ABRE）。全长cDNA序列和基因组DNA序列进行比较，发现该基因在编码区具有一个为257bp的内含子。成功的从油菜中克隆获得一个新的脱水素基因BnDHN ERD10。油菜脱水素基因BnDHN ERD10全长cDNA为1114bp，含有一个816bp的开放阅读框（ORF），预测编码有271个氨基酸的脱水素蛋白。预测的等电点（pI）为5.09，分子量约为31kDa。BnDHN ERD10具有一个S-片段和两个K-片段，同源比对分析表明，这两个片段的保守性很高。RT-PCR用来进行BnDHN ERD10的表达图谱分析。结果表明BnDHN ERD10是组成型表达的基因，在根，茎和叶中都有表达。在外源脱落酸，低温和盐处理下，BnDHN ERD10的表达量都有所提高，这说明BnDHN ERD10的表达调控是通过依赖于脱落酸的信号传导途径。通过基因组步移，克隆了油菜脱水素基因BnDHN ERD10的5’-侧翼区序列，并对其进行了生物信息学的分析，对启动子基本活性元件和脱落酸应答相关的元件进行了预测。TATA-box位于转录起始位点前的-25bp处。在5’-侧翼区内具有两个脱落酸应答元件ABREs。从荠菜中克隆得到一个新的脱水素基因CbDHN。荠菜脱水素基因CbDHN的全长cDNA为983bp，含有一个720bp的开放阅读框（ORF），编码一个具有239个氨基酸的脱水素蛋白，预测计算的等电点（pI）为5.2，分子量约为27kDa。CbDHN具有一个S-片段和三个K-片段，同源比对分析表明，这两个片段的保守性很高。RT-PCR用来进行CbDHN的表达图谱分析。结果表明CbDHN是组成型表达的基因，在根，茎和叶中都有表达。在外源脱落酸，水杨酸，低温，干旱和盐处理下，CbDHN的表达量都有所提高，这说明CbDHN的表达是通过依赖于脱落酸的信号传导途径。为了进一步研究基因的功能，我们构建了四种植物表达载体：载体1（pCaMV35S∷BnDHN），载体2（pCaMV35S∷GbDHN），载体3（pCIP∷CbCOR15b，CIP：cold-induced promoter）和载体4（pGBP∷GUS）。构建植物表达载体时，用目的基因替换pCAMBIA1304的相应片段，构建出目的基因植物表达载体。得到的重组载体即为目的基因的植物表达载体，通过冻融法将其转化根癌农杆菌，即获得携带相应植物表达载体的农杆菌工程菌株。然后通过农杆菌介导的烟草叶盘转化法转化烟草。对得到的潮霉素抗性苗进行分子检测和功能验证正在进行中。脱水素基因的克隆为深入研究其在种子形成和逆境条件下的功能打下了基础，该研究对获得更多具有自主知识产权的功能基因、为利用基因工程技术改良农作物抗逆性具有潜在的重要意义。

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摘要

Abstract

引言

第一章文献综述

1.1 脱水素的性质

1.2 脱水素的结构

1.3 脱水素的分类

1.4 脱水素的分布和亚细胞定位

1.5 脱水素的表达调控

1.6 脱水素的功能和作用机制

1.7 本研究的目的和意义

第二章银杏脱水素基因（GbDHN）的克隆

2.1 实验材料

2.1.1 植物材料及处理

2.1.2 菌株和载体

2.1.3.培养基和抗生素

2.1.4 酶,试剂盒及分子量标准

2.1.5 引物

2.1.6 仪器和设备

2.2 实验方法

2.2.1 CTAB法提取银杏DNA

2.2.2 CTAB法提取银杏的RNA

2.2.3 GbDHN cDNA序列的克隆

2.2.4 GbDHN全长DNA序列的克隆

2.2.5 GbDHN5’侧翼区序列的克隆

2.2.6 电泳检测后,回收的片段连接、转化、筛选、测序

2.2.7 GbDHN Southern杂交

2.2.8 GbDHN基因表达图谱分析

2.2.9 生物信息学分析

2.3 结果与讨论

2.3.1 GbDHN全长cDNA序列的克隆和分析

2.3.2 GbDHN的DNA序列和5’侧翼区的克隆和分析

2.3.3 GbDHN的5’侧翼区顺式作用元件分析

2.3.4 GbDHN的亲水性分析

2.3.5 GbDHN的二级结构分析

2.3.6 GbDHN同源分析

2.3.7 GbDHN Southern blot分析

2.3.8 GbDHN表达图谱分析

第三章油菜脱水素基因（BnDHN ERD10）的克隆

3.1 实验材料

3.1.1 植物材料及处理

3.1.2 菌株和载体

3.1.3.培养基和抗生素

3.1.4 酶,试剂盒及分子量标准

3.1.5 引物

3.1.6 仪器和设备

3.2 实验方法

3.2.1 TRIZOL法提取油菜总RNA

3.2.2 CTAB法提取油菜的DNA

3.2.3 BnDHN ERD10全长cDNA的克隆

3.2.4 BnDHN ERD10 5’侧翼区序列的克隆

3.2.5 特异目的条带回收后,连接、转化、筛选,测序的具体操作见2.2

3.2.6 BnDHN ERD10表达图谱分析

3.2.7 生物信息学分析

3.3 结果与讨论

3.3.1 BnDHN ERD10全长cDNA序列的克隆和分析

3.3.2 BnDHN ERD10的5’侧翼区的克隆和分析

3.3.3 BnDHN ERD10的亲水性分析

3.3.4 BnDHN ERD10的二级结构分析

3.3.5 同源分析

3.3.6 BnDHN ERD10表达图谱分析

第四章荠菜脱水素基因（CbDHN）的克隆

4.1 实验材料

4.1.1 植物材料及处理

4.1.2 菌株和载体

4.1.3.培养基和抗生素

4.1.4 酶,试剂盒及分子量标准

4.1.5 引物

4.1.6 仪器和设备

4.2 实验方法

4.2.1 试剂盒提取荠菜总RNA

4.2.2 CTAB法提取荠菜的DNA

4.2.3 CbDHN全长cDNA的克隆

4.2.4 CbDHN表达图谱分析

4.2.5 生物信息学分析

4.3 结果与讨论

4.3.1 CbDHN全长cDNA序列的克隆和分析

4.3.2 CbDHN的亲水性分析

4.3.3 CbDHN的二级结构分析

4.3.4 同源分析

4.3.5 CbDHN表达图谱分析

第五章植物表达载体的构建和遗传转化进展

5.1 前言

5.2 实验材料

5.2.1 菌株和质粒

5.2.2 酶,试剂及分子量标准

5.2.3.引物

5.2.4 植物材料及培养基

5.3 实验方法

5.3.1 植物表达载体的构建

5.3.2 叶盘法转化烟草

5.3.3 转基因苗的检测

5.3.4 转基因烟草植株的抗冻分析

5.4 结果和讨论

5.4.1 植物表达载体的构建及分析

5.4.2 转基因烟草苗的分子检测

5.4.3 转基因烟草植株的抗冻分析

总结

参考文献

附录

攻读博士学位期间发表的论文

致谢

攻读博士学位期间参与的其他工作

银杏、油菜和荠菜脱水素基因的克隆和研究

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