毛竹紫黄质脱环氧化酶基因的克隆与功能研究

论文摘要

适应各种光照环境是植物生存的本能,叶黄素循环在植物适应强光环境、光破坏防御和适应低光环境、提高光能利用效率过程中都发挥着重要作用。叶黄素循环含有三种组分,即紫黄质、花药黄质和玉米黄质。当植物吸收的光能超过其转化能力时,类囊体腔被过度酸化,低pH能够激活紫黄质脱环氧化酶,催化紫黄质生成玉米黄质的反应。玉米黄质能够将过量光能以热能的形式耗散掉,而且能够清除一些氧自由基,以减轻过量光能对植物产生的伤害。而在低光照下,玉米黄质在玉米黄质环氧化酶的作用下转化为紫黄质,减少光能的热耗散,从而提高植物的光能利用率。毛竹（Phyllostachys edulis）是分布于我国亚热带地区的散生竹种,具有较高的经济价值。本论文以毛竹实生苗为材料,在研究叶片叶绿素荧光动力学参数的基础上,开展了毛竹叶黄素循环关键酶-紫黄质脱环氧化酶的研究,以期为认识竹子叶黄素循环在不同光照环境中的作用提供分子生物学基础,主要研究结果如下:第一,毛竹叶片叶绿素荧光动力学研究。利用叶绿素荧光技术,研究了毛竹实生苗叶片叶绿素荧光参数非光化学猝灭（NPQ）和电子传递速率（ETR）的变化规律。结果表明,充分暗适应后,随着光合有效辐射（PAR）逐渐增强,NPQ也随之增加,而ETR则呈现先上升,后下降的趋势。其表明NPQ在过量光能热耗散过程中发挥重要作用。第二,基因克隆。将不同物种的紫黄质脱环氧化酶（VDE）同源蛋白序列进行比对,设计简并引物,扩增得到毛竹VDE基因的部分cDNA序列,再通过RACE方法,获得5′和3′端序列,经拼接获得了基因全长cDNA（1723 bp）,编码区为1356 bp,共编码451个氨基酸（其中N端的103个氨基酸为转运肽）,该基因命名为PeVDE。根据PeVDE的编码区序列设计引物,以基因组DNA为模板进行扩增,经测序结果表明毛竹PeVDE基因编码区基因组序列含有4个内含子和5个外显子。第三,基因的原核表达。将编码PeVDE成熟蛋白的基因序列克隆入原核表达载体pET-32b中,得到含有目的基因的重组表达载体。将该表达载体转入大肠杆菌表达菌株（Rosetta-gamin B （DE3））感受态细胞,进行原核诱导表达。通过优化诱导条件,在30℃条件下,0.4 mmol·L-1 IPTG诱导4 h,获得了表达丰度较高的可溶蛋白。第四,酶活性测定。通过超声破碎细菌,提取PeVDE重组总蛋白,以紫黄质为反应底物,在25℃、pH 5.1条件下暗处反应15 min,应用HPLC法检测反应产物。结果显示,反应产物中除了有紫黄质外,还有花药黄质和玉米黄质组分,由此证明重组蛋白具有生物学活性,能够将紫黄质依次转化为花药黄质和玉米黄质。第五,Western blotting分析。用原核表达所得的重组蛋白免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体。分别提取毛竹实生苗的根、茎、叶鞘和叶片组织的总蛋白,并通过SDS-PAGE进行分离,以PeVDE的多克隆抗体为探针进行检测。Western Blotting结果表明,在茎、叶鞘和叶片中都能检测到PeVDE,其中以叶片中含量最高,其分子量约为50 kDa,而在根中没有检测到。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 引言
• 1.1.1 研究背景
• 1.1.2 国内外研究现状及评述
• 1.2 研究的目标和主要内容
• 1.2.1 关键的科学问题与研究目标
• 1.2.2 主要研究内容
• 1.3 研究技术路线
• 第二章 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 菌株和质粒载体
• 2.1.3 主要试剂
• 2.1.4 主要仪器
• 2.1.5 引物
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 毛竹实生苗的培育
• 2.2.2 毛竹叶片叶绿素荧光测定
• 2.2.3 毛竹叶片基因组DNA 提取（CTAB 法）
• 2.2.4 毛竹叶片总RNA 提取（Trizol 法）
• 2.2.5 cDNA 第一条链的合成
• 2.2.6 基因保守片段克隆
• 2.2.7 高保真酶Pyrobest 扩增反应和加A 反应
• 2.2.8 PCR 产物的回收纯化
• 2.2.9 目的片段和克隆载体的连接
• 2.2.10 连接产物的转化
• 2.2.11 大肠杆菌（DH5α）电击感受态制备
• 2.2.12 质粒DNA 的小量提取
• 2.2.13 质粒酶切鉴定
• 2.2.14 RACE-Ready cDNA 合成
• 2.2.15 基因编码区克隆反应体系与条件
• 2.2.16 基因5′端克隆反应体系与条件（5′RACE）
• 2.2.17 基因3′端克隆反应体系与条件（3′RACE）
• 2.2.18 目的基因基因组序列扩增体系与反应条件
• 2.2.19 毛竹紫黄质脱环氧化酶成熟蛋白编码区序列的扩增
• 2.2.20 原核表达载体构建
• 2.2.21 原核表达载体转化重组表达菌株
• 2.2.22 重组表达菌株的诱导表达
• 2.2.23 SDS-PAGE
• 2.2.24 蛋白表达的可溶性分析
• 2.2.25 表达蛋白的纯化
• 2.2.26 表达蛋白的活性鉴定
• 2.2.27 毛竹叶片总蛋白提取
• 2.2.28 多克隆抗体制备
• 2.2.29 Western Blotting
• 第三章 结果与分析
• 3.1 毛竹叶片叶绿素荧光动力学研究
• 3.2 毛竹紫黄质脱环氧化酶基因的克隆与序列分析
• 3.2.1 保守区片段的克隆
• 3.2.2 基因5′端的克隆
• 3.2.3 基因3′端的克隆
• 3.2.4 基因全长的获得及编码区的克隆
• 3.2.5 基因组DNA 序列的克隆
• 3.2.6 PeVDE 基因的系统进化树分析
• 3.3 毛竹紫黄质脱环氧化酶的原核表达及其活性鉴定
• 3.3.1 原核表达载体的构建和重组表达菌株的转化
• 3.3.2 重组表达载体的诱导表达
• 3.3.3 重组蛋白的纯化
• 3.3.4 重组蛋白的体外活性鉴定
• 3.3.5 Western Blotting 结果分析
• 第四章 结论与讨论
• 4.1 结论
• 4.2 讨论
• 4.2.1 毛竹叶片叶绿素荧光动力学研究
• 4.2.2 毛竹紫黄质脱环氧化酶基因的克隆与分析
• 4.2.3 毛竹紫黄质脱环氧化酶的原核表达和功能鉴定
• 4.3 展望
• 参考文献
• 附录
• 在读期间的学术研究
• 致谢