壳聚糖硬脂酸聚合物胶团给药系统抗肿瘤药效学研究

论文摘要

聚合物胶团给药系统是近年来研究十分活跃的靶向控释给药系统。其特有的核.膜结构,既提供了一个疏水的内核作为药物储库,又提供了一个亲水的外膜以维持在水性环境中的稳定性。因而它可以增加疏水性药物在水中的溶解度,作为药物增溶的一条途径。纳米级范围的粒径有效促进了聚合物胶团的“渗透与保留作用”,赋予其被动靶向肿瘤组织的功能。聚合物胶团表面的配体或抗体修饰可帮助其达到主动靶向的目的。与传统的低分子量表面活性剂相比,聚合物胶团具有更低的临界胶团浓度,因而在水中具有更高的稳定性。然而聚合物胶团是一个动态体系,其核一膜结构的外层水性膜就像一扇活动门控制着药物的进出。而药物与疏水性内核的作用仅依赖于较弱的分子间作用力,如范德华力、氢键、静电吸引等。因此,一经体液急剧稀释,胶团变得松散,甚至解离,以致出现药物渗漏、暴释现象。本研究以15.0 KDa的低分子量壳聚糖（chitosan oligosaccharide,CSO）为原料,以碳二亚胺为缩合剂,将硬脂酸（stearic acid,SA）的羧基共价结合到壳聚糖链的游离氨基上,得到壳聚糖硬脂酸聚合物（stearic acid grafted chitosan oligosaccharide copolymer,CSO-SA）。以三硝基苯磺酸法测定聚合物氨基取代度;以芘荧光法测定该聚合物在水中的临界胶团浓度;以荧光淬灭法测量该聚合物在水中自聚集后形成的疏水核区域;以微粒粒度及表面电位分析仪测定聚合物胶团在水中的粒径与表面电位。以戊二醛（glutaraldehyde,Glu）为交联剂,对壳聚糖硬脂酸聚合物胶团进行表面固化,考察戊二醛浓度对固化胶团粒径和表面电位的影响。选择合适的固化终止剂即时终止交联反应。以水难溶性抗肿瘤药物阿霉素碱基（doxorubicin alkali,DOX）为模型药物,进行聚合物胶团载药性能研究。考察胶团载药前后粒径与表面电位变化,并进行包封率和载药量测定,以及研究经戊二醛固化前后的体外释放。以A549、LLC和SKOV3为模型细胞进行聚合物胶团固化前后的摄取实验,考察表面固化对聚合物胶团细胞摄取的影响,并进行各给药系统的细胞药效评价。利用壳聚糖链游离氨基和叶酸分子游离羧基的反应活性,对壳聚糖硬脂酸聚合物进行叶酸修饰。考察叶酸修饰前后聚合物胶团理化性质的变化,并以戊二醛为表面交联剂,对叶酸修饰聚合物胶团进行表面固化。以A549（FR=（-））,LLC（FR=37%）和SKOV3（FR=93%）细胞系为模型细胞,考察叶酸修饰对聚合物胶团选择性摄取的影响。以阿霉素碱基为模型药物,考察叶酸修饰对胶团载药行为和细胞药效的影响。分别取B16黑色素实体瘤和Lewis肺癌实体瘤,接种于C57BL/6小鼠宿主右腋皮下。考察不同载药量的阿霉素载药胶团和叶酸修饰阿霉素载药胶团,对荷瘤小鼠尾静脉注射后的肿瘤治疗效果。定期测量瘤株体积,以相对肿瘤体积（RTV）和相对肿瘤增值率（T/C）为反应指标,评价不同制剂的抑瘤效果。经生物酶降解得到重均分子量为15.0 KDa的低分子量壳聚糖在水中具有良好的溶解性。采用偶合反应对其进行疏水性修饰,得到氨基取代度为3.48%的壳聚糖硬脂酸聚合物（CSO-SA）,在水中的临界胶团浓度为0.035 mg·mL-1。1.0 mg·mL-1浓度的聚合物胶团溶液中,单个CSO-SA分子的疏水性微区域数为2.8个。1.0 mg·mL-1浓度的聚合物胶团溶液,数均粒径为35.0 nm,表面电位为57.1±1.5 mV。以戊二醛为表面交联剂对聚合物胶团进行表面固化,当聚合物与戊二醛的摩尔比为1∶5、1∶10、1∶15时,胶团粒径减小,表面电位降低;当聚合物与戊二醛的摩尔比为1∶20时,胶团之间发生交联,固化胶团粒径明显增大;当聚合物与戊二醛的摩尔比为1∶2.5时,由于戊二醛量太少,表面固化程度过低,固化胶团的粒径和表面电位未发生明显改变。以A549、LLC和SKOV3为模型进行细胞摄取实验,发现壳聚糖硬脂酸聚合物胶团可自行进入细胞,且LLC和SKOV3的细胞摄取率高于A549细胞;摩尔比为1∶5的固化反应不影响细胞摄取。以抗肿瘤药物阿霉素碱基为模型药物进行载药试验,药物包封率在90%以上。对以上三种细胞系进行48 h毒性试验,发现聚合物载药胶团的抗肿瘤活性较游离阿霉素显著增加,且对SKOV3细胞的增殖抑制率最为明显,这得益于其对聚合物胶团的高摄取率和对阿霉素碱基的低敏感性。经戊二醛表面固化的载药胶团呈现良好的药物缓释特征,并可进一步提高抗肿瘤能力。对壳聚糖硬脂酸聚合物进行叶酸修饰,提高了聚合物胶团在水中的自聚能力,并进一步增加了聚合物胶团的疏水核数。对A549（FR=（-））,LLC（FR=37%）和SKOV3（FR=93%）细胞系的摄取实验结果表明,叶酸分子的表面修饰,对肿瘤细胞A549的细胞摄取无明显影响,但显著增加了对过表达叶酸受体的肿瘤细胞LLC和SKOV3短时间内的细胞摄取百分率,这种差距随孵育时间的延长而减小。叶酸分子的表面修饰,对阿霉素载药胶团的药物包封率和载药量无影响,但在一定程度上减慢了药物的体外释放。叶酸修饰载药胶团在细胞水平抗肿瘤作用较游离阿霉素显著提高,但与无叶酸修饰的载药胶团相比,几乎无差异,这与孵育时间延长,两种聚合物胶团的细胞摄取总量趋向一致相关。叶酸修饰胶团的表面固化不影响细胞摄取能力,但进一步增加了聚合物结构的紧密性,减少了药物渗漏,增加了细胞药效。对B16黑色素瘤和Lewis肺癌实体瘤的治疗研究发现,载药阿霉素胶团均显示出较阳性对照组高的肿瘤抑制率,并且1/5剂量组亦显示出较高的抑瘤率,对B16黑色素瘤的治疗作用与对Lewis肺癌的治疗作用相似。叶酸配体修饰的阿霉素载药胶团,显示出较未修饰制剂组更高的抗肿瘤效果,1/2剂量组显示出与阳性对照ED100几乎一致的抑瘤率,1/5剂量组的肿瘤抑制率亦高于未修饰制剂1/5剂量组。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一章 壳聚糖硬脂酸聚合物的合成及其理化性质研究
• 1 试剂与仪器
• 2 实验方法
• 2.1 壳聚糖硬脂酸聚合物合成
• 2.2 壳聚糖硬脂酸聚合物理化性质研究
• 3 结果与讨论
• 3.1 壳聚糖硬脂酸聚合物合成
• 3.2 聚合物氨基取代度
• 3.3 聚合物临界胶团浓度
• 3.4 聚合物疏水核数
• 3.5 聚合物胶团粒径与表面电位
• 4 小结
• 第二章 壳聚糖硬脂酸聚合物胶团的表面固化与细胞药效研究
• 1 试剂与仪器
• 2 实验方法
• 2.1 固化胶团制备及固化终止剂选择
• 2.2 聚合物胶团细胞摄取考察
• 2.3 阿霉素载药胶团的制备及其理化性质考察
• 2.4 阿霉素载药胶团体外释放研究
• 2.5 阿霉素载药胶团细胞药效评估
• 3 结果与讨论
• 3.1 固化胶团制备及固化终止剂选择
• 3.2 聚合物胶团细胞摄取研究
• 3.3 阿霉素载药胶团的制备及其理化性质考察
• 3.4 阿霉素载药胶团体外释放
• 3.5 阿霉素载药胶团细胞药效
• 4 小结
• 第三章 壳聚糖硬脂酸聚合物叶酸修饰研究
• 1 试剂与仪器
• 2 实验方法
• 2.1 叶酸修饰壳聚糖硬脂酸聚合物的合成
• 2.2 叶酸修饰壳聚糖硬脂酸聚合物的理化性质评价
• 2.3 叶酸修饰壳聚糖硬脂酸聚合物固化胶团的制备
• 2.4 叶酸修饰聚合物胶团细胞摄取研究
• 2.5 阿霉素载药胶团的制备及其理化性质考察
• 2.6 阿霉素载药胶团体外释放评价
• 2.7 阿霉素载药胶团细胞药效评估
• 3 结果与讨论
• 3.1 叶酸修饰壳聚糖硬脂酸聚合物的合成及理化性质
• 3.2 叶酸修饰聚合物胶团细胞摄取研究
• 3.3 阿霉素载药胶团药物包封率和载药量
• 3.4 阿霉素载药胶团体外释放研究
• 3.5 叶酸修饰聚合物载药胶团细胞药效评估
• 4 小结
• 第四章 阿霉素载药胶团对荷瘤小鼠抗肿瘤药效学研究
• 1 试剂与仪器
• 2 实验方法
• 2.1 阿霉素载药胶团制备
• 2.2 叶酸修饰阿霉素载药胶团制备
• 2.3 实际载药量测定
• 2.4 荷瘤小鼠模型建立
• 2.5 实体瘤治疗实验
• 3 结果与讨论
• 3.1 阿霉素制剂载药量测定
• 3.2 实体瘤治疗效果
• 4 小结
• 结论
• 参考文献
• 综述
• 致谢